Analyse der posttranslationalen Modifikationen von Proteinen in den Mikrofilarienscheiden von Litomosoides sigmodontis

Abstract

Filariosen sind weit verbreitete Erkrankungen bei Mensch und Tier in den Tropen. Nach Schätzungen der WHO sind derzeit etwa 400 Mio.Menschen infiziert [1]. Auslöser dieser Krankheit sind Nematoden wie Wuchereria bancrofti und Brugia-Arten, die für ihre VermehrungArthropoden als Vektoren benutzen. Zur Untersuchung der Filariosen und ihrer Pathogenese im Labor hat sich Litomosoides sigmodontis als Tierfilarien-Art in einem gutcharakterisierten Wirtstiermodell bewährt (Nager: Sigmodon hispidus). Trotz sehr komplexer immunologischer Beobachtungen während des Krankheitsverlaufs beim mit Litomosoides infizierten Wirt, ist jedochganz allgemein ein Rückgang der Immunreaktion gegenüber deren Larven, den Mikrofilarien, charakteristisch. Diese sind allseitig voneiner Hülle, der Scheide, umgeben, die sie in bislang ungeklärter Weise vor Angriffen des Wirts-Immunsystems schützt. Untersuchungen ananderen Nematodenfamilien deuten auf verschiedene Evasionsmechanismen der Erreger hin, wie z.B. molekulare Mimikry oderchemische Modifikation der Filarienenoberfläche, welche eine modulierende Wirkung auf das Wirts-Immunsystem ausüben. Daher ist diebiochemische Analyse der L. sigmodontis- Mikrofilarienscheide zum besseren Verständnis der molekularen Vorgänge bei derImmunevasion von großer Bedeutung. In der Mikrofilarienscheide von L. sigmodontis sind selektiv die beiden Oberflächen-Polypeptide shp3 und shp3a hochgradigposttranslational mit dem biogenen Amin Dimethylaminoethanol (DMAE) modifiziert [2], welches antidepressive Eigenschaften besitzt. Mit Hilfe der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie (NMR) wurde die Struktur von DMAE als das Fmoc-Derivat ausführlichbeschrieben. Insbesondere weist shp3a massenspektrometrisch, per MALDI-TOF-MS, einen Modifikationsanteil von 75% seinerGesamtmasse auf, bzw. 25% DMAE. Eine Dephosphorylierung mit HF ergab einen Massenverlust von ca. 18 kDa, was 110Phospho-DMAE-Resten entspricht. Die Modifizierung mit DMAE ist derart charakteristisch, dass es analytisch zur Differenzierung vonanderen Scheidenpolypeptiden als Marker dienen kann. Die DMAE-Homologen Cholin und Monomethylaminoethanol (MMAE) wurdenlediglich in Spuren detektiert. Des weiteren lassen sich shp3 und shp3a, im Gegensatz zu anderen Scheidenproteinen, in der SDS-PAGEmit Stains-All® individuell färben, was auf polyanionische Eigenschaften hinweist [3]. Das Ergebnis der Bausteinanalysen in den L. sigmodontis-Mikrofilarienscheiden weist mit ca. 6% N-Acetylgalaktosamin, 3% Galaktoseund 0.2% Uronsäuren ausschließlich auf O-glykosidisch gebundene Kohlenhydrate hin [4,5]. Zur Untersuchung der Glykosylierung wurdendie Kohlenhydrate durch Hydrazinolyse sowie reduktive [beta]-Eliminierung freigesetzt. Die massenspektrometrische Analyse ergabmonomeres N-Acetylgalaktosamin und das Disaccharid Gal1-3GalNAc. Zum Unterschied zu gewöhnlichen O-Glykanen sind sie nicht, wieallgemein beobachtet, durch Sialinsäuren, Fucose oder Sulfat terminiert und ähneln dem sog. Tn- bzw. T-Antigen. In Kombination mitMALDI-TOF-MS ergab die Methylierungsanalyse mittels GC/MS ein Trisaccharid mit der ungewöhnlichen Sequenz Gal1-3-Gal1-3-GalNAc.Darüber-hinaus haben vergleichende Analysen vor und nach HF-Behandlung ergeben, dass sieben OH-Gruppen des Trisaccharids mitPhospho-DMAE verestert sind, von denen vier auf der terminalen Galaktose lokalisiert wurden; die drei restlichen Positionen sind nichteindeutig zuordenbar. Durch die chemische Synthese von an Rinderinsulin und -serumalbumin gekoppeltem Phospho-DMAE als Hapten standen Produkte für dieGewinnung von Antikörpern sowie für den Einsatz in histochemischen Experimenten zur Verfügung.

Lymphatic filariases are wide-spread diseases in humans and beasts in the tropics. According to the WHO about 400 million individualsare estimated to be infected [1]. Lymphatic diseases are caused by nematodes like Wuchereria bancrofti and Brugia species, employingarthropods as vectors. The rodent filaria, Litomosoides sigmodontis, and its mammal host, Sigmodon hispidus, have been found to be a competent modelsystem for laboratory studies on filariasis and its pathogenesis. Despite of very complex immunological implications during the pathogenesis of an Litomosoides-infected host, a concomitant decrease ofthe immune response towards the larvae, i.e. microfilariae, is characteristic. These are ensheathed, and -still for unknown reasons-protected against immune attacks of the host. Yet, recently observed featured of the micro-filariae, such as molecular mimikry or chemicallymodified surfaces, are suggested to have modulating effects on the host's immune system. Therefore, the biochemical analysis of themodifications in the Litomosoides sigmodontis-microfilarial sheath is considerably important to help elucidate the molecular mechanismsinvolved during immune evasion. Exclusively two surface polypeptides of the L. sigmodontis-microfilarial sheath, shp3 and shp3a, are posttranslationally modified by thebiogenic amine, dimethylaminoethanol (DMAE), which is known for its antidepressive properties. The structure of DMAE was extensively described by nuclear magnetic resonance as the Fmoc-derivative. As revealed by amino acidanalysis and MALDI-TOF-mass spectrometry, the modifications of shp 3a accounted for 75% of its molecular mass, and 25% of DMAE,respectively [2]. Upon dephosphorylation with hydrofluoric acid (HF) the loss of mass of ca. 18kDa correlated with the amount of 110phosphorylated DMAE-residues. The DMAE-homologues, choline and monomethylaminoethanol, were detected only in trace amounts. Incontrast to other sheath polypeptides, shp3 and shp3a could be stained with the cationic dye, Stains-All, in SDS-PAGE, thus suggesting apoly-anionic structure [3]. Component analyses of carbohydrates yielded 6% (w/w) of N-acetylgalactosamine, 3% (w/w) of galactose and 0.2% (w/w) of uronic acids,suggesting the presence of O-glycans. By means of hydrazinolysis, reductive beta-elimination and mass spectrometry, the carbohydratemoiety was subjected to a detailed structural analysis. Mass spectrometric analyses yielded mono-meric N-acetylgalactosamine and thedisaccharide, Gal1-3GalNAc.Unlike other O-glycans, these were not substituted by a sialic acid, a fucose nor a sulfate residue, thusresembling the so-called Tn- and the T-antigen, respectively. The data based on combined MALDI-TOF-MS, methylation analysis (GC/MS) and HF-treatment revealed a trisaccharide with an unusualsequence, Gal1-3Gal1-3GalNAc. Seven OH-groups of the trisaccharide were substituted with phosphorylated DMAE. Four of which couldbe located on the terminal galactose, the remaining three residues were not exactly assigned. Finally, the chemical synthesis of bovine insulin and serum albumin, both substituted with phosphorylated DMAE as a hapten, wassuccessful. These synthetic products were purified via HPLC and could be employed to achieve antibodies for further histochemicalexperiments.