AMPA-([alpha]-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure) induzierte Exzitotoxizität im Innenohr der Taube (Columba livia)

Abstract

Bei Nicht-Säugern, speziell beim Vogel, kommt es nach einem durch Schall oder ototoxische Substanzen verursachten Innenohrtrauma, zu einerspontanen Regeneration der Haarzellen und weitreichender funktioneller Erholung des Hörvermögens. In bisherigen Untersuchungen konnte gezeigtwerden, daß beim Vogel die funktionelle Erholung des Hörvermögens nach Innenohrtrauma, trotz spontaner Regeneration der Haarzellen, nichtvollständig ist. Ziel dieser Studie war es herauszufinden, ob die nach Haarzellschädigung und Regeneration beobachtete unvollständige Restitutiondes Hörvermögens nach alleiniger Nervenfaserschädigung ausbleibt. In einem ersten Schritt wurde mit immunhistochemischen Methoden untersucht, ob AMPA-Rezeptoruntereinheiten im Innenohr der Taube exprimiertwerden. Durch die Verwendung von polyklonalen Antikörpern gegen GluR1, GluR2, GluR3 und GluR4 konnte gezeigt werden, daß dieseAMPA-Rezeptoruntereinheiten im Innenohr des Vogels exprimiert werden. Eine punktförmige immunreaktive Färbung konnte sowohl auf denGanglienzellen als auch unterhalb der Haarzellen, in der Region der Synapsen, für GluR2/3 und GluR4, nicht aber für GluR1 festgestellt werden. Aufden Haarzellen selbst konnte eine immunreaktive Färbung für GuR4 nachgewiesen werden. Die Immunoblotanalyse zeigte für die Antikörper gegenGluR1, GluR2/3 und GluR4 Banden bei dem Molekulargewicht der Proteine von 100 kDa. In einem zweiten Schritt wurden die Auswirkungen von AMPA auf die afferenten Hörnervenfaserendigungen morphologisch und physiologischuntersucht. Es zeigte sich, daß die afferenten Hörnervenfaserendigungen durch Applikation von AMPA in den Recessus scalae tympani (30µl/15min.) geschädigt wurden. Der Verlauf der CAP (Compound action potential)-Hörschwellenkurven wurde sowohl über einen Zeitraum von 8 Stunden,als auch über einen Zeitraum von mehreren Monaten ermittelt. In ebenfalls durchgeführten Kontrollversuchen, bei denen künstliche Perilymphe ohneAMPA infundiert wurde, traten keine Hörverluste auf. Somit konnte eine Schädigung des Innenohres bzw. Hörverluste durch den operativen Eingriffoder durch die Infusion ausgeschlossen werden. Die beobachteten Hörverluste sind also spezifisch auf die Wirkung von AMPA zurückzuführen. Beider Applikation von 1 mM AMPA-Lösung konnte eine Erhöhung der Hörschwellen um bis zu 80 dB im hochfrequenten Bereich und bis zu 30 - 40 dBim tieffrequenten Bereich über den Zeitraum von mehreren Stunden beobachtet werden. Am dritten Tag nach der AMPA-Applikation zeigten alleuntersuchten Tiere eine Verbesserung der Hörschwellen um 20 - 40 dB. Weitere Messungen über den Zeitraum von zwei bis drei Monate zeigten,daß bei einigen Tieren innerhalb von 7 - 21 Tagen die Hörschwellenkurven die Ausgangswerte des unbehandelten Ohres erreichten, daß aber beider Mehrheit der Tiere eine Anhebung der Hörschwellen von ca. 20 - 30 dB im hochfrequenten Bereich bestehen blieb. Die mittlere bleibendeSchwellenanhebung, gemittelt für alle Frequenzen, betrug 8 dB + 5 dB. Bei den Tieren, bei denen ein hochfrequenter Verlust bestehen blieb,erreichten auch die ermittelten CAP-Amplituden bei den hohen Frequenzen ihre Ausgangswerte nicht mehr. Zusätzlich zu den CAP-Schwellenkurven wurden 13 - 15 Wochen nach AMPA-Instillation die Antworteigenschaften einzelner Hörnervenfasernerhoben. Fasern, deren charakteristische Frequenz (CF) über 0,3 kHz lag, zeigten signifikant erhöhte CF-Schwellen. Für Fasern mit CF-Wertenüber 0,4 kHz wurden verminderte Q10dB-Werte gefunden, während die Spontanentladungsrate für Fasern mit CF-Werten über 0,18 kHz erhöht war.Die maximale Entladungsrate war bei allen Fasern, für die dieser Wert ermittelt wurde (n = 20), ebenfalls erhöht. Neurone, deren CF über einemWert von 1,5 kHz lag, konnten, methodisch bedingt, nicht untersucht werden. Diese beobachteten funktionellen Veränderungen in der Aktivität undSensitivität der auditorischen Neurone weisen darauf hin, daß es bei der Wiederherstellung der Verbindung zwischen Haarzelle und neuralerSynapse zu dauerhaften Schäden kommt. Mittels elektronenmikroskopischer Darstellung konnten bei den Tieren, die direkt nach der Infusion (nach 10 min.) der AMPA-Lösung dekapitiertwurden, große vakuolisierte afferente Terminalien unterhalb der Haarzellen gefunden werden. Die efferenten Nervenendigungen waren nichtbeschädigt. Während im apikalen Bereich der Papilla basilaris sehr viele Vakuolen bzw. zerstörte afferente Nervenfaserendigungen zu sehenwaren, konnten deutlich weniger Vakuolen im medialen Teil und nur sehr wenige Vakuolen im basalen Teil gefunden werden. Dieser Befundkorreliert mit der Verteilung der afferenten Nervenfasern entlang der Papilla basilaris. Bei Tieren, die zwei Wochen nach der AMPA-Applikationdekapitiert wurden, konnten keine morphologischen Veränderungen mehr gefunden werden. Die untersuchten Papillen waren von den Kontrollohrennicht mehr zu unterscheiden. Dies zeigt, daß auf struktureller Ebene scheinbar eine vollständige Rekonstitution der Verbindung zwischen Haarzelleund Synapse stattfindet. Dieser Befund steht im Widerspruch zu den elektrophysiologisch erhobenen Daten. Festzuhalten bleibt, daß auch bei ausschließlicher Schädigung der afferenten Nervenendigungen und trotz deren Neubildung ein residualerHörverlust bestehen bleibt. Als Ursache für die mangelhafte funktionelle Erholung des Hörvermögens könnten durch die längere Abwesenheit derNervenfaserendigungen hervorgerufene Veränderungen der Eigenschaften der Haarzellen oder eine veränderte Expression und Funktion derGlutamatrezeptoren in Frage kommen. Hair cells in the inner ear of birds regenerate after destruction by acoustic trauma or ototoxic drugs. There is a significant functional recovery fromhearing loss, but small residual deficits remain, possibly as a result of incomplete reestablishment of the hair cell-neural synaptic contacts. To studyfunctional recovery associated with the reinnervation process independent of hair cell loss and regeneration it was investigated if AMPA, a glutamateagonist with excitotoxic effects, can be used to cause disruption of the hair cell neural synapses in birds. It was shown by immunohistochemical studies using polyclonal antibodies directed against subunit GluR1, GluR2/3 and GluR4 (Chemicon) thatAMPA receptor subunits are expressed in the avian basilar papilla. Cy3-linked antirabbit IgG's were used as the secondary antibody. Cyrostatsections (20 µm) of paraformaldehyde fixed inner ears showed specific punctuate immunoreactive staining of auditory ganglion cell bodies and atthe level of the base of the hair cells. Staining was positive for subunits GluR 2/3 and GluR4 but not for GluR1. Immunoreactive staining was alsoobserved at the hair cell level for subunit GluR4. Immunoblot analysis with antibodies to GluR2/3 and GluR4 recognized molecular weight proteins ofapproximately 100 kDa. In spite of the immunohistochemical result a polypeptide band could be detected using Anti-GluR1. We examined the effect on inner ear physiology by applying (S)-AMPA (Tocris-Neuramin) to the perilymph of the pigeon tympanic recess.Compound action potential (CAP) responses to tone bursts were used to determine hearing thresholds. They were recorded by round windowelectrodes chronically implanted before drug application. Functional recovery was studied for up to 4 months after trauma using CAP audiogramsrecorded at regular intervals from the same animal. The properties of single auditory nerve fibers were analyzed after 3 to 4 months of recovery.AMPA was perfused for 15 min with a total of 30 µl (1mM) through a small hole in the tympanic recess. This method led to immediate abolition ofCAP thresholds. Control solution (30 µl Hanks) had no effect on the CAP thresholds. Preliminary results indicate that NMDA another glutamateagonist, has no effect on the CAP thresholds, using the same method. There was little recovery of thresholds up to 8 hours after application ofAMPA. Partial recovery was observed after one day. After perfusion, recovery proceeded over 2-3 weeks. High frequency thresholds did not reachcontrol values in this period. The response properties obtained 12 to 14 weeks after AMPA treatment showed the following characteristics when compared to control data:CF-thresholds (CF = characteristic frequency) were elevated in units with CF above 0.3 kHz, sharpness of tuning (Q10dB) was reduced in units withCF above 0.4 kHz, spontaneous firing rate was elevated in units with CF above 0.18 kHz and the maximum discharge rate was also elevated. Anatomical alteration of the dendrites as a function of AMPA treatment between day 0 and 14 was assessed using transmission electronmicroscopy. The nerve endings went through a sequence of swelling, degeneration and recovery, over a 3 to 7 day period. This process ofneo-synaptogenesis was completed at day 14 post exposure. The results show that AMPA receptor subunits are expressed by the auditory afferent nerve fibers in the avian inner ear and that the glutamateagonist AMPA causes reversible abolition of auditory nerve responses to sound. However, small residual functional deficits remain. These findingsare strong evidence for a role of glutamate or a related excitatory amino acid as the afferent transmitter in the avian inner ear. This suggests alsothat despite structural regeneration of the basilar papilla, functional recovery of the auditory periphery is incomplete at the level of the hair cell or thehair cell-afferent synapse.