Altersabhängige Expression und Lokalisation des Progesteron- und Östrogenrezeptors-alpha im Eberhoden

Abstract

Neben Östrogenen konnte in vorausgehenden Untersuchungen auch Progesteron als ein Produkt der testikulären Steroidproduktion erkannt werden. Für beide Steroide stellt sich die Frage nach deren Relevanz für die endokrine und germinative Hodenfunktion. Vorliegende Arbeit fokussiert auf Progesteron, ihr liegt die These zugrunde, dass es sich dabei wie auch bei Estron um einen parakrin/autokrin wirksamen Regelfaktor handelt. Als eine erste Stütze dieser These wird der Nachweis des Progesteronrezeptors und Östrogenrezeptors-alpha im Hoden angesehen. Die Untersuchungen zum Nachweis des PR erfolgten mittels Immunhistochemie und RT-PCR, die zum Nachweis des ER-a nur mit RT-PCR. Der RT-PCR schloß sich eine Sequenzierung der Amplifikate an. Zur Verfügung standen jeweils Hoden von fünf 50, 100, 150, 200 und mehr als 250 Tage alten Ebern. Für die Immunhistochemie wurden ca. 1 x 1 x 1 cm große Würfel aus dem Hodenparenchym geschnitten, in 4%-igem Formol nach Lillie für 20-24 Stunden fixiert und in Paraffin eingebettet. Für die RT-PCR wurde das Gewebe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 85°C gelagert. Als Kontrolle diente ein entsprechend behandelter Schweineuterus. Nach alkoholischer Entparaffinierung in einer absteigenden Xylol-Ethanol-Reihe und Rehydrierung wurden 3µm starke Schnitte zur Demaskierung der antigenen Epitope in Citratpuffer in der Mikrowelle erhitzt. Danach folgte eine Inaktivierung der endogenen Peroxidasen in einer 2%-igen H2O2-Lösung. Für die Darstellung des PR kam der monoklonale Antikörper (Klon 10A9; ImmunotechÒ) zur Anwendung, der gegen das hochkonservierte Carboxyende des humanen PR gerichtet ist. Die Darstellung erfolgte via zweiten Antikörper und einem Avidin-Biotin Detektionssystem. Positivkontrolle und Negativkontrolle (Verwendung eines irrelevanten Isotypenantikörpers) bestätigten die Spezifität der Immunreaktion. Die Auswertung und Auszählung der Schnitte erfolgten bei 400-facher und 1000-facher Vergrößerung, die statistische Auswertung mit dem Statistikprogramm BMDP/Dynamic, Release 7.0 (Dixon, 1993). Die Aufbereitung der Gewebeproben zum Nachweis des PR und ER-a mittels RT-PCR geschah in gleicher Weise unter Verwendung des RNeasy-Kit der Firma QiagenÒ. Die RT-PCR wurde in einer einstufigen Reaktion mit dem One-Step RT-PCR Kit (QiagenÒ) durchgeführt. Zur Amplifikation des Progesteron- und Östrogenrezeptors alpha wurden für das Schwein bzw. für das Rind spezifische Primerpaare eingesetzt (Malayer und Woods, 1998; Ying et al., 2000). Als Kontrolle diente die Erfassung der Expression des Housekeeping Genes b-Aktin für das ebenfalls ein spezifischer Primer zur Verfügung stand (Ying et al., 2000). Die Sequenzierung der Amplifikate eines Hodens aus der 250 Tage bzw. 50 Tage Gruppe ergab eine nahezu 100%-ige Homologie mit der erwarteten Sequenz für den Progesteron- bzw. Östrogenrezeptor-a. Ein entsprechendes Ergebnis ergab sich für das Endometrium. Mittels RT-PCR konnte die Expression des PR und ER-alpha bei allen fünf Altersgruppen nachgewiesen werden. Immunhistochemisch zeigte sich die Expression des PR vor allem in den Spermatogonien, wobei bei den präpubertären Tieren (50 und 100 Tage alt) die Expression offensichtlich an die Kontaktaufnahme der zur Peripherie wandernden Präspermatogonie mit der Basalmembran gebunden ist; der Effekt war mit p< 0,0001 hochsignifikant, 65,34 ± 6,6% der 50 Tage Gruppe und 72,96 ± 11,59% der 100 Tage Gruppe waren PR positiv. Bei den adulten Tieren (Tag 200 und 250) waren 77,8 ± 3,2% der A- und 79,1 ± 3,0% der B-Spermatogonien PR-positiv. Nach Teilung der B-Spermatogonien in die primären Spermatozyten verlor sich die Expression. Es waren keine Expressionsunterschiede in Abhängigkeit vom Alter (Tag 200 und 250) und zum Stand der Spermatogenese nachzuweisen. In keiner Altersgruppe ergaben sich Hinweise auf eine Expression des PR in den Leydigzellen, die Expressionen des PR in den Sertolizellen und den peritubulären Zellen bedarf einer weiteren Untersuchung. Die Befunde lassen auf eine parakrine Bedeutung von Progesteron bei der Spermatogoniogenese schließen. In previous investigations apart from oestrogens also progesterone was identified as a product of testicular secretory activity. Both steroids raise the question in respect to their importance for testicular endocrine and germinal function. The present thesis focuses on progesterone with the hypothesis that progesterone like oestrogens acts as a paracrine/autocrine regulatory factor. Demonstration of testicular expression of the progesterone- and oestrogenreceptor-a are seen as a support of this hypothesis. Detection of the PR was by immunohistochemistry and RT-PCR, of the oestrogenreceptor-a by RT-PCR only. Investigations were performed with testes from groups of 5 boars aged 50, 100, 200 and >250 days. For immunhistochemistry testicular tissue was cut into approximatly 1 x1 cm cubes, which were fixated in 4% formol by Lillie for 20-24 hours prior to embedding in paraffin. For RT-PCR tissue was shock frozen and stored at 85°C until further use. Pig uterine tissue served for control purposes. 3μm slices were cut, deparaffinized and rehydrated; antigenic epitops were demasced by heating in citrate-buffer in a microwave oven. Endogenous peroxydases were then inactivated by treatment with a 2% H2O2-solution. For detection of the progesterone receptor the monoclonal antibody Klon 10A9 (Immunotech®) was used. This antibody is directed against the highly conserved carboxyterminus of the human progesterone receptor. Detection was via a 2nd antibody and the avidin-biotin-system. Specificity of the immunereaction was proven by adequate positive (uterus) and negative controls, also using a nonsense antibody. Slices were examined at a 400- and 1000- fold magnification, where appropriate statistical evaluation was by the program BMDP/Dynamic, Release 7.0 (Dixon, 1993). For RT-PCR of the progesterone- and oestrogenereceptor-a the mRNA was obtained by using the RNeasy-Kit (Qiagen®). Following transcription (One-step, Qiagen®) and amplification the amplicons were visulized after electrophoresis on an ethidium-bromide gel. The primers used were specific for the porcine progesterone (Ying et al., 2000) and bovine oestrogenreceptor-a (Malayer und Woods, 1998 ), sequencing of the amplicons from a 250 day (PR) and 50 day (ERa) old boar yielded an almost 100% homology with the expected sequences. Similar results were obtained with the uterine control tissue, RT-PCR of the housekeeping gene alpha-Actin confirmed correctness of the RT-PCR. By RT-PCR expression of the PR and ERa could be demonstrated at all age groups. Immunhistochemistrily located the PR particularely in spermatogonia. As was shown in prepubertal boars (50, 100 days), centrally located pre-spermatogonia were largely negative and only expressed the PR after having moved to and getting in contact with the basal lamina (p< 0,0001); 65.3 ± 6.6% and 72.9 ± 11.6% of the pre-spermatogonia of the 50 and 100 day old boars, respectively, were PR-positive. In adult boars (200 and >250 days) 77.8 ± 3.2% of the A-spermatogonia und 79.1 ± 3.9% of the B-spermatogonia expressed the PR. There were no differences between age groups or relations to the stage of spermatocytogenesis. Expression was lost after entering the stage of spermatogenesis. Leydig cells were constantly negative, only few sertoli cells and peritubular cells occasionally stained positive, an observation needing further investigation. It is concluded that progesterone acts as a paracrine factor involved in the regulation of spermatogoniogenesis