Charakterisierung der molekularen Mechanismen der K-Ras/Akt-regulierten Motilität sowie der Funktion von Akt-Effektoren in Karzinomzelllinien mit onkogenem K-Ras

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2018

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10459

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Die Proteinfamilie der Akt-Kinasen besteht aus drei Mitgliedern, namentlich Akt1, Akt2 und Akt3. Die Akt-Kinasen sind hauptsächlich in der Regulation der Zellproliferation, des Überlebens, des Metabolismus und der Zellmigration involviert. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass nach stabiler Expression von onkogenem K-Ras(V12) die Ausbildung eines invasiven und motilen Phänotyps der Pankreaskarzinomzelllinie PANC-1 induziert wurde. Die Aktivierung des Phosphoinositid-3-Kinase(PI3-K)/Akt-Signalweges wurde dabei als essentiell für die K-Ras(V12)-induzierte Zellmotilität identifiziert. Die Analysen der vorliegenden Arbeit wiesen in EGFP-K-Ras(V12)-exprimierenden PANC-1- Zellklonen eine veränderte Expression der Akt-Isoformen sowie eine basal erhöhte Akt3-Aktivität nach. Aufbauend darauf wurden die individuelle Expression und Aktivität der Akt-Isoformen in etablierten Pankreas- und Lungenkarzinomzelllinien analysiert. Die Expressionsanalysen zeigten eine differentielle Akt1-, Akt2- und Akt3-Expression. In isoformspezifischen in vitro Akt-Kinase-Assays konnte in den Lungenkarzinomzelllinien COLO-699 und H23 eine deutliche, epidermal growth factor (EGF)-induzierte Akt3-Aktivität detektiert werden, während in PANC-1 Zellen alle Akt-Isoformen in unterschiedlicher Stärke durch EGF aktiviert wurden. Für die Akt-Isoformen ist bekannt, dass sie eine individuelle Rolle in der Zellmigration in Abhängigkeit von der Zelllinie einnehmen können. Daher wurde in Wounding-Assays die Rolle der Akt-Kinasen und der einzelnen Akt-Isoformen in der Migration analysiert. In Assays mit PANC-1 und COLO-699 Zellen konnte nach Behandlung mit einem pan-Akt-Inhibitor eine deutlich verminderte Migration dokumentiert werden. In weiteren Studien wurden Akt1, Akt2 und Akt3 siRNA-vermittelt depletiert. Die Akt1-Depletion inhibierte die Migration von PANC-1 Zellen, PANC-1/EGFP-K-Ras(V12)-Zellklonen und H23 Zellen. Die Depletion von Akt2 oder Akt3 zeigte keinen Effekt auf die Migration dieser Zellen, mit Ausnahme von PANC-1/EGFP-K-Ras(V12)-Zellklonen, deren Motilität nach Akt2-Depletion gehemmt wurde. Um die zugrundeliegenden Akt-abhängigen Signalwege zu charakterisieren, wurden die Zellen mit spezifischen Inhibitoren und dem Akt-Aktivator SC-79 behandelt. In den Analysen von COLO-699 und PANC-1 Zellen konnten S6 und MDM2 als Akt-Substrate identifiziert werden. Um weitere Akt-Effektoren zu identifizieren, wurde ein Phospho-Akt-Substrat Proteom-Scan mit SC-79-behandelten H23 Zellen durchgeführt. In dieser Analyse konnten über 700 putative Akt-regulierte Phosphopeptide ermittelt werden. Einige dieser Akt-Effektoren sind an der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts beteiligt und könnten daher für die Migrationsregulation von Bedeutung sein. Insgesamt konnte somit erstmals ein K Ras(V12)-abhängiger Effekt auf die Akt-Isoform-Expression und Akt3-Aktivität gezeigt werden und die Rolle der Akt-Isoformen in der Migration als auch die Akt-abhängige Signaltransduktion in Pankreas- und Lungenkarzinomzellen näher charakterisiert werden.

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