Aktivierung und Effektorfunktionen humaner NK-Zellen nach Interaktion mit Leishmania

Abstract

Hintergrund und Fragestellung: Die einzelligen Leishmania-Parasiten, die Erreger der teils tödlich verlaufenden Leishmaniose werden über den Stich von Sandmücken auf viele unter-schiedliche Säugetiere, wie auch den Menschen, übertragen. Durch die fortschreitende Aus-breitung des Vektors und verstärkte Zuwanderung aus Endemiegebieten hat die Leishmaniose auch in Deutschland in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Leishmanien werden nach der Übertragung passiv über Phagozytose in unterschiedliche Zellen, vor allem Immunzellen, aufgenommen und vermehren sich intrazellulär. Eine effektive Immunantwort gegen Leishmanien ist daher mit der Produktion von leishmanizid wirkenden, reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (z. B. Stickstoffmonoxid [NO]) durch die infizierten Zellen selbst verbunden. Die NO-Produktion wird vor allem durch das Zytokin Interferon (IFN)-gamma induziert, das von T-Lymphozyten und Natürlichen Killer (NK)-Zellen produziert wird. Im Mausmodell der Leishmaniose konnte nachgewiesen werden, dass IFN-gamma von NK-Zellen bei einer Leishmanien-Infektion einen protektiven Effekt hat. Auch beim Menschen gibt es Hinweise darauf, dass NK-Zellen an der Immunabwehr von Leishmanien beteiligt sind. Allerdings sind die zugrundeliegenden Mechanismen der NK-Zell-Aktivierung im menschlichen Körper teils noch unklar und die bisher erzielten Ergebnisse kontrovers. In der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, ob aus dem Blut isolierte humane NK-Zellen in vitro in einem Zeitraum von 20 h durch Leishmanien aktiviert werden können und welche Faktoren hierfür notwendig sind.Ergebnisse: Die Kokultur von PBMCs mit promastigoten Stadien unterschiedlicher Leishma-nia-Arten führte zu einer gesteigerten Expression des Aktivierungsmarkers CD69 auf NK-Zellen. Die Stärke der Expression war spezies- und dosisabhängig, zeigte jedoch keinen Zusammenhang zum Organtropismus der jeweiligen Parasiten-Stämme. Während T- oder B-Lymphozyten keine Rolle spielten, wurden Leishmania-infizierte Monozyten als Induktoren der NK-Zell-Aktivierung identifiziert. Die Steigerung der CD69-Expression war dabei nicht abhängig von einer bestimmten Monozytensubpopulation. Sie konnte sowohl durch einen löslichen Faktor, der von Leishmania-infizierten Monozyten produziert wurde, als auch durch direkten Kontakt zwischen Monozyten und NK-Zellen ausgelöst werden. Während es in dieser Arbeit nicht möglich war, den löslichen Faktor zu identifizieren, konnte das auf Monozyten präsentierte, membrangebundene IL-18 für die kontaktabhängige Steigerung der CD69-Expression verantwortlich gemacht werden. Es wurden keine Hinweise auf eine direkte Akti-vierung der NK-Zellen durch Leishmanien gefunden. Trotz der CD69-Steigerung auf NK-Zellen wurde weder die Produktion von IFN-gamma noch eine NK-Zell-Zytotoxizität unter den genannten Bedingungen ausgelöst. Unter zusätzlicher Stimulation mit dem Zytokin IL-12 kam es jedoch in IL-18-abhängiger Weise zum Ablauf der genannten Effektormechanismen. Die Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten oder unreifen, aus Monozyten generierten dendritischen Zellen (Mo-DCs) in PBMC-Leishmania-Kokulturen hatte allerdings keinen Einfluss auf die Effektorfunktionen der NK-Zellen. Die zelluläre Quelle des für die Aktivierung benötigten IL-12 in einer in vivo-Situation ist daher bisher nicht geklärt. Vielversprechende Kandidaten sind, wie bereits im Mausmodel gezeigt, reife DCs.Neben den indirekten Effekten der Leishmanien auf NK-Zellen konnte auch eine direkte, kon-taktabhängige Interaktion gemessen werden, die zur verminderten Expression des Oberflä-chenmoleküls CD56 auf den NK-Zellen führte. Welche Auswirkungen diese Reaktion auf die allgemeine Funktionalität der NK-Zellen hat, bedarf weiterer Untersuchungen.Schlussfolgerungen: Die vorliegenden Daten zeigen, dass NK-Zellen nicht Leishmania-infizierter Menschen in vitro in sehr kurzer Zeit durch unterschiedliche Leishmania spp. aktiviert werden können und dass hierfür spezifische Signale weiterer Zelltypen, wie z. B. über Monozyten präsentiertes IL-18, notwendig sind. Für die Auslösung NK-Zell-spezifischer Ef-fektorantworten sind jedoch weitere Stimuli wie IL-12 notwendig. Obwohl die Quelle für IL-12 in einer in vivo-Situation noch unklar ist, ist es wahrscheinlich, dass NK-Zellen auch in dieser Situation an der frühen Abwehr einer Leishmania-Infektion beteiligt sind. Background and Hypothesis: Protozoan Leishmania parasites, which are the causative agents of potentially lethal leishmaniasis, are transmitted by the bite of sandflies to a variety of mammals, including humans. Due to progressive spreading of the vector and considerable immigration from endemic countries over the last years, leishmaniasis has also gained en-hanced medical significance in Germany. After transmission, Leishmania parasites are pas-sively taken up via phagocytosis by different cell types, mainly immune cells, and replicate intracellularly. Thus, an effective immune response against Leishmania is associated with the host cell production of leishmanicidal reactive oxygen and nitrogen species (e. g. nitrogen monoxide [NO]). The NO production is mainly induced by the cytokine interferon (IFN)-gamma, which is produced by T-lymphocytes and NK cells. In a murine model of leishmaniasis, it was shown that NK cell-derived IFN-gamma plays a protective role in Leishmania infections. Similarly, in the human system there are some evidences that NK cells contribute to the immune response against Leishmania. However, the underlying mechanisms of NK cell activation in the human context are not entirely known and the data are somewhat controversial, so far. Therefore, this study intended to analyse whether human blood-derived NK cells can be activated by Leishmania in vitro (within a period of 20 hours), and to identify the inducers or stimuli of NK cell activation in this context.Results: The coculture of PBMCs with different Leishmania spp. led to an increased expres-sion of the activation marker CD69 on NK cells. This reaction was species- and dose-dependent but independent of the organotropism of the different parasite strains. Leishmania-infected monocytes were identified as triggers of NK cell activation, whilst neither T- nor B-lymphocytes exhibited any stimulatory effect on NK cells. However, CD69 upregulation revealed as independent on the monocyte subtype. CD69 expression was triggered by both, a soluble factor being produced by Leishmania-infected monocytes, and by direct contact of monocytes and NK cells. In the current study it was not possible to identify the soluble factor but to elucidate monocyte-derived, surface-bound IL-18 as trigger of contact-dependent CD69 induction. Overall, there was no evidence of direct contact-dependent NK cell activation by Leishmania stages themselves or of CD69-induced production of IFN-gamma or NK cell cytotoxicity. For the latter reactions an additional stimulation with the cytokine IL-12 is obviously necessary, which is effective only in the presence of IL-18. However, the addition of neutrophil granulocytes or immature monocyte-derived dendritic cells to PBMC-Leishmania coculture, had no effect on the NK cell effector function. Therefore, the cellular source of the IL-12 needed for activation in an in vivo situation is still unclear. Similar to the mouse model, promising candidates for this function are mature DCs.Besides indirect effects of Leishmania on NK cells, a direct interaction between these cells led to a contact-dependent reduction of surface CD56 expression on NK cells. The consequences of this change on NK cell function will be analysed in future projects.Conclusion: The current study shows that NK cells originating from non-infected humans are activated in vitro by different Leishmania spp. within a very short time span, and that these reactions depend on specific signals of other cell types, such as monocyte-derived surface-expressed IL-18. In addition, to trigger NK cell effector functions, IL-12 is needed as additional stimulus. Although the actual source of IL-12 in an in vivo situation remains unclear, it appears likely that NK cells contribute to the early immune defence in Leishmania-infections.