Untersuchungen zur Funktion der RNase J in Rhodobacter sphaeroides

Abstract

Ribonukleasen sind die Enzyme, welche für Prozessierung und Degradation der RNA-Moleküle in einer Zelle verantwortlich sind. Die zu diesen Enzymen zählende RNase J wurde erst vor einigen Jahren in B. subtilis identifiziert und unterscheidet sich von den bisher bekannten bakteriellen RNasen in zweierlei Hinsicht. Erstens kann dieses Enzym RNA sowohl endo- als auch exo-ribonukleolytisch spalten und zweitens besitzt die exoribonukleolytische Aktivität eine bislang für bakterielle Ribonukleasen nicht bekannte 5´-3´ Orientierung. In B. subtilis ist die RNase J1 essentiell und spielt zusammen mit der paralogen RNase J2 eine Schlüsselrolle bei der Prozessierung und Degradation vieler RNAs in diesem Gram-positiven Organismus. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten erste Einblicke in die Aktivität und Funktion des RNase J homologen Proteins von R. sphaeroides gewonnen werden.Bei den in vitro RNA-Degradationsstudien mit rekombinant aufgereinigter RNase J konnte gezeigt werden, dass dieses Enzym eine äußerst prozessive exoribonukleolytische Aktivität besitzt und hierbei eine Präferenz für RNA-Substrate mit einem monophosphorylierten 5´-Ende aufweist. Eine für die RNase J von B. subtilis beschriebene, nahezu vollständige Inhibition der exoribo-nukleolytischen Aktivität durch ein triphosphoryliertes 5´-Ende wurde während dieser Arbeit jedoch nicht beobachtet. Die außergewöhnliche 5´-3´ Orientierung der RNA-Degradation durch die RNase J konnte prinzipiell auch für das homologe Enzym in R. sphaeroides bestätigt werden. Eine endo¬ribo¬nukleolytische Aktivität der RNase J ließ sich während der in vitro RNA-Degradationsstudien jedoch nur in geringem Umfang feststellen. Die beobachteten ribonukleolytischen Charakteristika der RNase J von R. sphaeroides werden vergleichend zu bekannten Eigenschaften von RNase J Homologen aus anderen Organismen diskutiert. Zusätzlich werden einige Aspekte der ribonukleolytischen Aktivität auf der Basis veröffentlichter RNase J Protein-Struktur Daten näher erläutert.Die RNase J von R. sphaeroides ist unter Standardwachstumsbedingungen nicht essentiell und eine Deletionsmutante wies keinen veränderten Phänotyp zum Wildtyp auf. Auf der RNA-Ebene führte die Deletion der RNase J zum Ausbleiben der finalen Reifung der 5´- als auch 3´-Enden der ribosomalen 23S rRNA-Fragmente. Mit Hilfe von in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass die RNase J von R. sphaeroides für die finale 5´-Prozessierung der 23S rRNA-Fragmente ver-antwortlich ist. Der sekundäre Effekt auf die Reifung der 3´-Enden führte zur Erstellung eines Modells für den Ablauf der einzelnen RNA-Reifungs Vorgänge an den 23S rRNA-Fragmenten.Die im Rahmen dieser Arbeit begonnene Auswertung einer RNASeq Transkriptom Analyse einschließlich erster Northern Blot Validierungen ergab, dass der RNase J möglicherweise eine weitere Funktion bei dem finalen Abbau einzelner Intermediate der RNA-Degradation in R. sphaeroides zukommt.