In der vorliegenden Arbeit wurde die Identifizierung und biochemische Charakterisierung von p120ctn als Interaktionspartner der Rho-GTPasen RhoA und RhoC in vitro und in der humanen Pankreaskarzinomzelllinie PANC-1 untersucht. p120ctn ist ein armadillo repeat-Protein aus der Familie der p120ctn Proteine und stabilisiert durch seine Bindung an die zytoplasmatische Domäne von E-Cadherin den für die Zell-Zell-Adhäsion wichtigen Cadherin-Catenin-Komplex an adherens junctions. Auf die Interaktion von p120ctn mit Cadherinen nehmen u. a. die Rho-GTPasen RhoA und RhoC Einfluss, die Mitglieder der Ras-Superfamilie sind und eine Aminosäuresequenzidentität von 92 % aufweisen. Castano und seine Mitarbeiter konnten bereits eine Interaktion von p120ctn mit RhoA nachweisen und die Bindungsdomäne auf p120ctn für RhoA auf den Aminosäuresequenzbereich 101-234 eingrenzen. In der Arbeitsgruppe von K. Giehl konnte erstmals eine Interaktion von RhoC mit p120ctn dokumentiert werden und eine unterschiedlich große Affinität der beiden Rho-GTPasen RhoA und RhoC gegenüber p120ctn festgestellt werden, was auf eine unterschiedliche Aminosäure auf Position 152 bei RhoC zurückzuführen ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine spezifische Methode zur vergleichenden Analyse der Interaktion von p120ctn mit den Rho-GTPasen RhoA und RhoC zu entwickeln und die Bindungsdomäne auf p120ctn weiter einzugrenzen. Hierfür wurde zunächst das GST-µMACS-System verwendet, welches aufgrund einer zu geringen Präzipitation von p120ctn für eine Co-Immunpräzipitation von Rho nicht geeignet war. Mit Hilfe des GST-Glutathion-Sepharose-Systems konnte eine Interaktion von p120ctn mit den Rho-GTPasen RhoA und RhoC bestätigt werden. Außerdem konnte erstmals die Bindungsdomäne von p120ctn für RhoC auf den Aminosäuresequenzbereich 101-234 eingegrenzt werden. Bei den durchgeführten Experimenten mit dem GST-Glutathion-Sepharose-System zeigte sich jedoch ebenfalls eine unerwünschte Interaktion zwischen Rho und GST, die auch durch zahlreiche Variationen der Versuchsbedingungen nicht eliminiert werden konnte, sodass weitere Versuchssysteme analysiert wurden. Es wurden Interaktionsstudien mit Protein G-Agarose und einem anti-GFP-Antikörper durchgeführt, um die Präzipitationsreihenfolge von p120ctn und den Rho-GTPasen zu verändern, was nicht zu einem Nachweis der Interaktion führte. Aufgrund einer unspezifischen Bindung von p120ctn an den Rho-Antikörper und die Protein A µMACS-Beads war jedoch auch dieses Versuchssystem nur bedingt geeignet. Außerdem wurden Versuchssysteme mit einem anti-HA (12CA5) Antikörper und HA-markierten Rho-GTPasen angewendet, die zwar zum Nachweis einer Interaktion zwischen p120ctn und den Rho-GTPasen führten, aber ebenfalls unspezifische Protein-Interaktionen aufwiesen. Schließlich wurden erstmalig aufgereinigte GST-Rho-Fusionsproteine im GST-µMACS-System eingesetzt und hiermit konnte die Interaktion zwischen p120ctn und RhoA bzw. RhoC bestätigt und eine höhere Bindungsaffinität von RhoC gegenüber p120ctn(1A) als RhoA nachgewiesen werden. Der Aminosäuresequenzbereich auf p120ctn konnte mit Hilfe des GST-µMACS-Systems für RhoA und RhoC auf 101-234 eingegrenzt werden. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit die Komplexität, ein ausreichend sensitives und reproduzierbares Versuchssystem unter Berücksichtigung der zahlreichen auf ein Experiment einflussnehmenden Faktoren zu etablieren. Eine Interaktion von p120ctn mit den Rho-GTPasen RhoA und RhoC konnte bestätigt werden und die Bindungsdomäne auf p120ctn auf den Aminosäuresequenzbereich 101-234 eingegrenzt werden.
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