Identifizierung einer Proteinkinase mit Calmodulin-ähnlicher Domäne bei Eimeria bovis und Studien zu ihrer Lokalisation im Parasiten
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Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wird bei Eimeria bovis, einem wichtigen Kokzid des Rindes, unter Verwendung von cDNA-Banken aus Merozoiten & #921; eine ungewöhnliche Serin/Threonin-Proteinkinase mit Calmodulin-ähnlicher Domäne (EbCDPK & #921;) identifiziert. CDPKs wurden bisher bei Pflanzen und einigen Protozoen einschließlich Apicomplexa gefunden, nicht aber bei metazoären Tieren. Die cDNA von EbCDPK 1 wurde sequenziert. Nach der Sequenzanalyse ließen sich im kodierten Protein mehrere funktionelle Domänen ermitteln, und zwar: eine katalytische Serin/Threonin-Kinasedomäne, eine Zwischensequenz und eine Calmodulin-homologe Domäne mit 4 Calciumbindungsstellen (EF-Hände). EbCDPK 1 ist damit Calmodulin-unabhängig und wird direkt durch die Bindung von Ca2+ aktiviert. Das Vorhandensein konservierter Aminosäuren in den Subdomänen und aktiven Zentren des Proteins läßt annehmen, daß die Kinase in vivo aktiv ist. Eine potenzielle Myristoylierungsstelle und ein Cluster aus vier basischen Aminosäuren am NH2-terminalen Ende lassen vermuten, daß EbCDPK 1 in einer Membran durch die Acylierung mit einem Myristinsäure-Rest verankert ist. EbCDPK 1 weist eine hohe Homologie zu bestimmten CDPKs aus Apicomplexa auf, welche sich einer von insgesamt drei phylogenetischen Gruppen zuordnen lassen. Drei überlappende Fragmente von EbCDPK 1 wurden in E. coli exprimiert und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Fragment 1 deckt die gesamte katalytische Domäne und einen Teil der Zwischendomäne, Fragment 2 einen COOH-terminalen Teil der katalytischen Kinasedomäne und die Calmodulin-homologe Sequenz, Fragment 3 die Calmodulin-homologe Sequenz ab. Nur die Antikörper gegen Fragmente 2 und 3 reagierten im Immunoblot mit EbCDPK 1 in Extrakten aus Sporozoiten, Merozoiten und infizierten Zellen (15 Tage p.i.) im Bereich von 57 kDa. Der Antikörper gegen Fragment 3 wurde zur Lokalisation des Antigens mittels konfokaler Laser-Rastermikroskopie (CLSM) in fixierten Parasiten benutzt. EbCDPK 1 ließ sich bei Methanol-fixierten Sporozoiten und Merozoiten & #921; vorwiegend im apikalen Bereich, mit gewisser Wahrscheinlichkeit in den Mikronemen, nachweisen. Bei Paraformaldehyd/Glutaraldehyd-fixierten Sporozoiten und Merozoiten & #921; kam es offensichtlich zur Antikörperbindung auf der Parasitenoberfläche, insbesondere im apikalen Bereich. Die mögliche Funktion von EbCDPK 1 wird im Zusammenhang mit der Lokalisation des Moleküls im Parasiten diskutiert.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2005