Activation of AMP-activated kinase at reperfusion protects the endothelial barrier against reperfusion-induced failure

Abstract

Capillary leakage and edema formation is a complication of hypoxia and/or ischemia, which can compromise the outcome of reperfusion and the recovery of organs. AMP-activated protein kinase (AMPK) is an intracellular energy sensor, which regulates cellular metabolism to maintain the energy homeostasis. Recent studies, however, show that AMPK plays an important role in other physiological functions. Here the hypothesis was addressed whether AMPK is involved in the regulation of endothelial barrier function and a targeted activation of AMPK at the onset of reperfusion can protect against reperfusion-induced endothelial barrier failure. Therefore, the role of AMPK in endothelial barrier function was analyzed in human umbilical vein endothelial cells under physiological and pathophysiological (hypoxiareperfusion) conditions. It was found that the downregulation of AMPKalpha protein or its isoforms (alpha1 and alpha2) with siRNA resulted in a significant increase in basal permeability, disintegration of adherens junctions, and enhanced actin stress fiber formation in cultured endothelial monolayers. Exposure of endothelial cells to hypoxia (60 min, Po2<5 mmHg) led to an increase in interendothelial gap formation, activation of the contractile machinery (MLC and MYPT1 phosphorylation), F-actin stress fiber formation, and loss of VE-cadherin and beta- catenin from cell-cell junctions. These parameters were further aggravated during reperfusion.Moreover, reperfusion also elicited translocation of both AMPKalpha isoforms from cytoplasm to the nucleus. Hypoxia caused a marked increase in AMPK phosphorylation which is associated with activation of the enzyme, however during reperfusion AMPK phosphorylation declined rapidly. Targeted activation of AMPK by the adenosine analog AICAR at the onset of reperfusion reduced interendothelial gap formation. Simultaneously MLC and MYPT1 phosphorylation was abolished, cortical actin rearranged at cell borders, VE-cadherin/beta catenin re-established at cell junctions, and cytonuclear translocation of AMPKalpha isoforms was prevented. This protective effect of AICAR on all parameters was abolished by the AMPK inhibitor Ara-A or by AMPKalpha1/2 siRNA transfection. In isolated reperfused mouse hearts, pharmacological activation of AMPK led to a significant reduction in ischemia-reperfusion induced increase in water content denoting reduction of edema formation. The data of this study show that AMPK is involved in the regulation of endothelial barrier function. Targeted activation at the onset of reperfusion can protect against ischemia/hypoxia-reperfusion induced endothelial barrier failure. Therefore, activation of AMPK may be a promising new therapeutic option to prevent reperfusion-induced endothelial barrier dysfunction.

Kapilläre Leckage und Ödembildung sind Komplikationen die bei Hypoxie und/oderIschämie auftreten und den Ausgang der Reperfusion und die Erholung von Organenkompromittieren können. Die AMP-aktivierte Kinase (AMPK) ist ein ntrazellulärer Sensor der den zellulären Metabolismus reguliert um die energetische Homöostase zu gewährleisten. Neuere Studien zeigen jedoch, dass die AMPK eine wichtige Rolle in Bezug auf andere physiologische Funktionen erfüllt. Hier wurde die Hypothese geprüft, ob die AMPK an der Regulation der endothelialen Schrankenfunktion beteiligt ist und ob eine AMPK gezielte Aktivierung zu Beginn der Reperfusion kann gegen Reperfusion-induziertes Schrankenversagen schützen. Zu diesem Zweck wurde die Rolle der AMPK in Bezug auf die endotheliale Schrankenfunktion in humanen Endothelzellen aus Nabelschnurvenen unter physiologischen und pathophysiologischen (Hypoxie-Reperfusion) Aspekten untersucht. Es fand sich, dass die Verminderung der AMPKalpha bzw. ihrer Isofomen (alpha1 und alpha2) mittels siRNA in einem signifikanten Anstieg der basalen Permeabilität, einer Disintegration von Adherens Junctions und einem Anstieg von Stressfaserbildung einherging. Aussetzen von Endothelzellen einer Hypoxie (60 min, Po2 < 5 mmHg) führte zu einem Anstieg interendothelialer Lückenbildung, Aktivierung des kontraktilen Apparates (MLC und MYPT1 Phosphorylierung), F-Aktin Stressfaser-Bildung und Verlußt von VE-Cadherin und beta-Catenin an Zellverbindungen. Diese Parameter verschlechterten sich im Verlaufe der Reperfusion.Darüberhinaus konnte eine Translokation beider AMPKalpha-Isoformen vom Zytoplasma in die Zellkerne beobachtet werden. Hypoxie induzierte einen Anstieg der AMPK Phosphorylierung, welche mit einer Aktivierung des Enzyms einhergeht, allerdings verschwindet diese Phosphorylierung während der Reperfusion rasch. Die gezielte Aktivierung der AMPK durch das Adenosinanalog AICAR zu Beginn der Reperfusion verminderte die interendotheliale Lückenbildung. Gleichzeitig wurde die Phosphorylierung von MLC und MYPT1 verhindert, kortikales Aktin ordnete sich ebenso wie VE-Cadherin/beta-Catenin an Zellgrenzen erneut an und die Kerntranslokation der AMPKalpha-Isoformen wurde verhindert. Dieser protektive Effekt von AICAR auf alle gemessenen parameter wurde jedoch durch den AMPK-Inhibitor Ara-A bzw. AMPKalpha1/2 siRNA Transfektion verhindert. In isolierten reperfundierten Mausherzen führte die pharmakologische Aktivierung von AMPK zu einer signifikanten Verminderung der Ischämie-Reperfusion induzierten Wassereinlagerung in das Gewebe, was eine Verminderung der Ödembildung kennzeichnet. Die Daten dieser Studie zeigen, dass AMPKan der Regulation der endothelialen Schrankenfunktion beteiligt ist. Die gezielte Aktivierung zu Beginn der Reperfusion kann gegen Ischämie/Hypoxie-Reperfusion induziertes Schrankenversagen schützen. Aus diesem Grund stellt die Aktivierung der AMPK eine mögliche neue therapeutische Option gegen reperfusions-induziertes endotheliales Schrankenversagen dar.