Analyse der DNA-Reparaturmechanismen nach therapeutischer Genomeditierung mittels induzierbarer Cas9 Endonuklease in vitro

Abstract

Erblich bedingte Netzhauterkrankungen betreffen viele Menschen und sind häufig verantwortlich für den Verlust der Sehkraft. Begründet liegen sie meist in einer Mutation eines relevanten Gens. Es existieren unterschiedliche therapeutische Optionen, die abhängig von dem Wissen um die Ursache und dem Fortschritt der Erkrankung zum Einsatz kommen. Therapeutische Genomeditierung, das damit einhergehende Einbringen eines DSBs sowie die nachfolgenden zelleigenen Reparaturmechanismen stellen eine wichtige Rolle im Bereich der Gentherapie dar. Ziel dieser Arbeit war es, das BRET-Reportersystem in Verbindung mit einer induzierbaren Cas-Variante zu testen und mehr Informationen über das neuronenspezifische Verhalten nach einem induzierten DSB zu generieren. Nachdem die Funktionalität des bereits in der Arbeitsgruppe entwickelten BRET-Systems mit den entsprechenden gRNA/Cas9-Komplexen bestätigt wurde, folgte die Herstellung eines induzierbaren Cas9-Systems passend zu den Targetsequenzen der BRET-Reporter, welche in HEK293-T-Zellen transfiziert und auf ihre Funktionalität hin überprüft wurden. Im letzten Schritt der Arbeit wurde versucht, das Cas9-System mit gRNA und BRET-Reporten mittels Cotransfektion in die iNGNs zu integrieren. In Zukunft kann die Kombination der gRNA/iCas mit anderen Reportersystemen zu weiteren Informationen über das zellspezifische Reparaturverhalten nach einem DSB führen. Hier sollte jedoch zunächst die Erhöhung der Transfektionseffizienz der iNGNs im Fokus stehen und durch Änderung der Transfektionsmethode, der DNA-Bereitstellung und/oder des Promotors gesteigert werden. Kurzfristiges Ziel ist es, die iNGNs als intermediäres System mit gRNA/iCas-Systemen zu etablieren, um neuronenspezifische Informationen im Bereich der DNA-Reparaturforschung in Bezug auf erblich bedingte Netzhauterkrankungen generieren zu können. Langfristig steht die Ermöglichung einer direkten Therapie von erblich bedingten Erkrankungen mittels Genome Editing im Zentrum des Bestrebens. Zukünftig könnten CRISPR/(i)Cas und iPSCs somit einen wesentlichen Beitrag zu einer patientenspezifischen, regenerativen Medizin leisten.