Untersuchungen zur Rolle der Cyclin-abhängigen Kinasen bei der NF-κB-vermittelten de novo Proteinsynthese und der Sekretion inflammatorischer Mediatoren

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2023

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-18086

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Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) sind Serin/Threonin Proteinkinasen, deren enzymatische Aktivität durch korrespondierende Cycline reguliert wird. Einige CDKs kontrollieren den Fortschritt des Zellzyklus, während andere CDKs über die Phosphorylierung der C-terminalen Domäne (CTD) der RNA Polymerase II eine entscheidende Rolle bei der Genexpression spielen. Zu Letzteren gehören die Elongations-assoziierten Kinasen CDK12 und CDK13, welche Serin2 der CTD während der transkriptionellen Elongation phosphorylieren. Aufgrund der Beteiligung von CDKs an diesen essentiellen biologischen Prozessen, werden CDK Inhibitoren intensiv als potentielle anti-proliferative und pro-apoptotische Therapeutika für die Behandlung von Tumorerkrankungen evaluiert. Das pro-inflammatorische Zytokin Interleukin 1 (IL 1) kontrolliert entzündungsfördernde Reaktionen im Kontext von Infektionen, Gewebsverletzungen und Tumoren. Dabei induziert IL-1 einen Signalweg, welcher in der Phosphorylierungs-abhängigen Degradation von Inhibitoren des Transkriptionsfaktors NF-κB resultiert, welcher daraufhin in den Zellkern transloziert und spezifische Genexpressionsprogramme aktiviert. Viele Zielgene von NF-κB codieren für Faktoren, welche von der Zelle sezerniert werden und die Entzündungsreaktion weiter fördern oder unterbinden. Die durch IL-1 und NF-κB regulierten Faktoren tragen zu einem tumorfördernden, inflammatorischen Tumormikromilieu bei. Zu Beginn dieser Arbeit deuteten unveröffentlichte, massenspektrometrische Analysen des Phospho-Proteoms darauf hin, dass einige CDKs (inklusive CDK12 und CDK13) nach erfolgter Stimulation von HeLa Zellen mit IL-1 transient phosphoryliert werden. Ziel der Arbeit war es daher, das Zusammenspiel zwischen dem IL-1-NF-κB Signalweg und CDKs in Bezug auf die Genexpression und Proteinsekretion inflammatorischer Mediatoren auf funktioneller Ebene zu entschlüsseln. Die Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche pharmakologische CDK Inhibitoren diverse Phänotypen hervorrufen. Der pan-CDK Inhibitor Flavopiridol supprimiert die IL-1 induzierte Genexpression und Proteinsekretion weitgehend. Der selektive CDK12/13 Inhibitor THZ531 führt zu einer Suppression der Expression einiger IL-1 Zielgene, während die Expression anderer Zielgene deutlich induziert wird. Grund hierfür könnte die Beeinflussung des negativen Regelkreislaufs des Signalwegs, durch die verlangsamte (Re)-Synthese der NF-κB Inhibitoren IκBα und A20, sein. Der PROTAC BSJ 4 116, welcher eine zielgerichtete Degradation von CDK12 und CDK13 induziert, supprimiert zeit- und dosisabhängig die IL-1 vermittelte Aktivierung wichtiger Komponenten des IL-1-NF-κB Signalwegs sowie die Genexpression und die Proteinsekretion inflammatorischer Mediatoren. Die spezifische Degradation von CDK12 und CDK13 über ein Auxin-induziertes Degron System bzw. über siRNA-vermittelte Depletion beeinflusst den IL-1-NF-κB Signalweg hingegen kaum. In einem separaten Ansatz wurde in dieser Arbeit zudem eine auf KLICK Chemie basierte Methode etabliert, die eine unvoreingenommene Analyse des sekretierten Proteoms in Anwesenheit von Serum zulässt. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl Serumentzug als auch die IL-1 Stimulation spezifische und unterschiedliche Gruppen von sekretierten Proteinen als Reaktion auf Stress oder Entzündungsreize aktivieren. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass alle drei untersuchten CDK Inhibitoren die Transkriptionselongation (gemessen an der RNA-Pol II CTD-Phosphorylierung), die Proliferation und das Überleben von vier verschiedenen Tumorzelllinien in vergleichbarer Weise unterdrücken, im Einklang mit ihren veröffentlichten Wirkungen auf einige der Hauptmerkmale von malignen Tumoren. Allerdings unterscheiden sich die Inhibitoren stark in ihren Auswirkungen auf die IL-1-NF-κB vermittelte Genexpression und Proteinsekretion. Diese Wirkungen könnten durch off target Effekte (auf andere Kinasen), nicht-kanonische Funktionen der CDKs oder auf eine Kombination dieser beiden Möglichkeiten zurückzuführen sein. Andererseits deutet der milde Phänotyp des genetischen Ansatzes zur Hemmung von CDK12 und CDK13 darauf hin, dass beide Kinasen hochspezifische Funktionen haben oder durch andere Mitglieder der CDK Familie kompensiert werden können. Diese Daten geben auch Hinweise auf einen nicht-kanonischen, IL-1 regulierten Weg, der durch noch unbekannte Mechanismen die Sekretion von Entzündungsmediatoren trotz Unterdrückung der CDK12/13 Aktivität aufrechterhält.

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