Zytoskelettassoziierte Moleküle und Integrinaktivierung in bovinen Plazentazellen : in vivo und in vitro Studie
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Zusammenfassung
Integrine sind eine für die Zelladhäsion wichtige Gruppe von transmembranen Glykoproteinrezeptoren aus nicht kovalenten Heterodimeren, welche einerseits mit der extrazellulären Matrix (ECM) interagieren und andererseits für Signaltransduktion in die Zelle verantwortlich sind. Es wurde bereits gezeigt, dass Integrine bei der eingeschränkten Trophoblastinvasion der Rinderplazenta von großer Bedeutung sind. Um die Bedeutung der Signalübertragung über Integrine in der bovinen Plazenta genauer untersuchen zu können, wurde von unserer Arbeitsgruppe eine Primärkultur aus Karunkelepithelzellen etabliert, an der die Integrinuntereinheiten alpha6, alphav, beta1 und beta3 nachgewiesen werden konnten. Mittels der vorliegenden Arbeit werden drei Zielsetzungen verfolgt. Im ersten Teil der Arbeit sollte eine bessere Verfügbarkeit der Primärzellkultur erreicht werden, indem ein Verfahren zur Kryokonservierung der Zellen entwickelt wurde. Diese Methode wurde über den Nachweis der Zytoskelettfilamente & #945;-sm Aktin, Desmin und Zytokeratin, sowie der Expression von Fibronektin, welche mittels indirekter Immunfluoreszenz dargestellt wurden, validiert. Es wurden jeweils die eingefrorenen mit den nativen Zellen verglichen und eine signifikante Dedifferenzierung ausgeschlossen. In dem zweiten Teil der Arbeit sollte die Funktionalität der Integrinbindung nachgewiesen werden, da der reine Nachweis eines Integrinrezeptors nicht ausreicht, um seine Beteiligung an Signalübertragungen zu belegen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz wurden zum einen die typischen Fokalkontakte histomorphologisch nachgewiesen und zum anderen durch Doppelmarkierung die Kolokalisationen der Integrinuntereinheit beta1 mit den Signalmolekülen alpha-Aktinin, fokale Adhäsionskinase (FAK), Phosphotyrosin (PT) und Talin, sowie die Kolokalisationen FAK mit PT und Talin detektiert. Alle genannten Moleküle wurden mittels indirekter Immunfluoreszenz sowohl in der Zellkultur als auch im Gefrierschnitt der Plazentome zunächst einzeln nachgewiesen. Die Spezifität der Antikörper gegen die Integrinuntereinheit beta1, alpha-Aktinin, FAK und Talin wurde im Western blot überprüft. In einem dritten Schritt wurde durch das Aussäen der Zellkultur auf mit Fibronektin (FN), Laminin (Lam) und Kollagen IV (Koll) beschichteten 6-Wells im Vergleich zu unbeschichteten Wells untersucht, in wie weit unterschiedliche Matrices das Zellwachstum sowie die Integrin- und Signalmolekülexpression beeinflussen. Der Einfluss auf das Zellwachstum wurde durch eine Auszählung der mit DAPI angefärbten Kerne bestimmt. Die Integrin- und Signalmolekülexpression wurde qualitativ anhand der indirekten Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen die Integrinuntereinheit beta1, alpha-Aktinin, PT und Talin beurteilt. Die Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung der Zellkultur ließ folgende Kolokalisationen erkennen: Entlang der Zell-zu-Zell Kontakte zeigte sich die Integrinuntereinheit beta1 sowohl mit alpha-Aktinin als auch mit FAK kolokalisiert. Die Doppelmarkierung mit PT ergab eine enge Nachbarschaft beider Moleküle. Innerhalb der Fokalkontakte konnte die Integrinuntereinheit beta1 mit Talin und FAK kolokalisiert werden. Des Weiteren wurden Kolokalisationen bei der Doppelmarkierung von FAK mit Talin beziehungsweise mit PT beobachtet. Als Besonderheit ließ sich darstellen, dass die Fokalkontakte am Rand der Zellkolonien zwar Talin, aber kein FAK enthalten. Die Varianzanalyse ergab eine signifikante Verbesserung des Zellwachstums auf allen Beschichtungen im Vergleich zu der unbeschichteten (U) Unterlage (p-Werte: FN vs. U = 0,0001; Lam vs. U = 0,0013; Koll vs. U = 0,0400). Des Weiteren konnte das Wachstum auf Fibronektin als signifikant besser als auf den beiden anderen Beschichtungen nachgewiesen werden (p-Werte = 0,0001). Bezogen auf die Fokalkontakte kam es bei allen untersuchten Signalmolekülen zu einer Vermehrung auf der Fibronektinbeschichtung. Bei Talin war auch eine Vermehrung auf der Kollagen IV- und der Lamininbeschichtung zu erkennen. Mit der vorliegenden Arbeit wurde die Funktionalität der Integrinbindung in der untersuchten Zellkultur nachgewiesen. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die untersuchte Karunkelepithelzellkultur aus tragenden Rindern eine gute Grundlage für weiterführende Untersuchungen der Integrinsignalübertragung darstellt. Von besonderem Interesse sind diesbezüglich feto-maternale Kontaktstudien, die Aufschluss über die Regulation der eingeschränkten Trophoblastinvasion geben können.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2008