Die Faktor VII-aktivierende Protease (FSAP) ist eine zirkulierende Serinprotease hepatischen Ursprungs. Der mit 5% Vorkommnis auftretende Einzelnukleotidpolymorphismus (G534E) Marburg I der FSAP geht mit einer deutlich reduzierten Enzymaktivität einher, und korreliert mit diversen vaskulären Erkrankungen wie Arteriosklerose, vaskulärer Kalzifizierung und Fibrose. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnten aufweisen, dass FSAP das Cystein-Knoten Protein platelet derived growth factor PDGF-BB degradiert, was eine Reduktion des fibrotischen Verhaltens von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC) im Mausmodell nach sich zog. Da FSAP Proteinaktivität im Zusammenhang mit fibroproliferativen und degenerativen Erkrankungen assoziiert ist, war es fraglich, ob FSAP weitere Mitglieder der strukturell verwandten transforming growth factor-&
#946; (TGF-&
#946;) Superfamile der Cystein-Knoten Proteine reguliert. Dafür sollten deren reife Wachstumsfaktoren sowie ihre latenten Proformen untersucht werden.In dieser Arbeit wurden Mitglieder der bone morphogenetic protein (BMP) und der growth and differentiation factor (GDF) Familie als neue Substrate der FSAP identifiziert, die im Zusammenhang mit osteogener Zelldifferenzierung stehen und anti-proliferativ wirken. In diversen in vitro Zellsystemen wurde der Einfluss der FSAP auf die biologische Aktivität von BMP-2, pro-BMP-2, pro-GDF-5 sowie TGF-&
#946; untersucht. FSAP spaltete und verstärkte die biologische Aktivität von reifen BMP-2 konzentrations- und zeitabhängig. Amino-terminale Peptid-Sequenzierung identifizierte eine Spaltung innerhalb basischer Aminosäuren und die Generierung eines um 7 Aminosäuren verkürztes Peptids (R298-K290). Ebenso wurden die latenten Proformen pro-BMP-2 und pro-GDF-5 prozessiert. Pro-BMP-2 wurde durch FSAP innerhalb der Furinspaltstelle RXXR in die reife Form überführt (R282-Q283) und zusätzlich an der gleichen Stelle wie reifes BMP-2 (R289-K290) verkürzt. Um die Spezifität der FSAP auf die Wachstumsfaktor Aktivierung zu überprüfen, wurde eine Vergleichsstudie mit diversen Proteasen durchgeführt. Lediglich strukturell verwandtes Plasmin stellte sich als BMP Aktivator heraus. Überraschenderweise erwies sich TGF-&
#946;-1 nicht als FSAP Substrat. Die biologische Aktivität der prozessierten Wachstumsfaktoren wurde durch die Induktion der alkalischen Phosphatase Aktivität, Smad1/5/8-Phosphorylierung und der anti-proliferative Effekt in C2C12 Myoblasten untersucht. Die FSAP-induzierte gesteigerte biologische Aktivität der BMPs war durch den BMP-Inhibitor Noggin reversibel. Die FSAP Behandlung von BMP-2 und pro-BMP-2 führte außerdem zu ihrer verstärkten Internalisierung. Neben Myoblasten reagierten auch VSMCs auf FSAP behandeltes BMP-2 und pro-BMP-2 durch Smad1/5/8 Phosphorylierung sowie Induktion der BMP-VSMC Zielgene Id1 und Smad6. Um die Rolle von endogener FSAP zu ermitteln, wurden Hepatozyten mit FSAP siRNA transfiziert um FSAP herunter zu regulieren, und die BMP-Prozessierung mittels Aktivierung untersucht. Eine Minderung des endogenen FSAP Gehalts führte zu einer Reduktion der BMP-Spaltung und Aktivität, was sich durch Induktion des hepatischen Zielgens Hepcidin nachweisen lies. Um die beteiligten Aminosäuren der Wachstumsfaktorspaltung durch FSAP zu ermitteln, wurde eine Mutationsstudie mit pro-BMP-2 durchgeführt. Dafür wurden 5 verschiedene Konstrukte mit je einem Aminosäurenaustausch (Arg&
#61664;Serin) kloniert (K278S, R282S, K285S, R282S, K290S) und in HEK293 Zellen exprimiert. Sowohl die reifen Peptide als auch zu geringerem Anteil ihre latenten Proformen wurden sekretiert. Die Mutationen hatten jedoch keinen Einfluss auf die FSAP induzierte Spaltung. Eine Triple-Mutationsstudie mit den pro-BMP-2 Mutanten SSS282 und der Mutation SSS289 in der reifen BMP-2 Kette ergab, dass nur die SSS289 Variante vor der FSAP Proteolyse geschützt war. Die Mutation der Prodomäne führte zu einer deutlich reduzierten Sekretion.In dieser Arbeit wurde ein neuer positiver Aktivierungsmechanismus von BMP-2 sowie seiner Proform durch FSAP und Plasmin identifiziert. Daher ist FSAP ein neuer Aktivator von Differenzierungs- und pro-osteogenen Faktoren. Zusammen mit dem Befund, dass FSAP den pro-proliferativen Wachstumsfaktor PDGF-BB inhibiert, vermag FSAP die Proliferation und Differenzierung von vaskulären Zellen zu kontrollieren, und den Phänotyp zur Kalzifizierung voranzutreiben. Diese reziproken Mechanismen könnten die Rolle der FSAP als Risikofaktor in fibroproliferativen und degenerativen Gefäßkrankheiten wie Arteriosklerose und vaskuläre Kalzifizierung erklären.
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