Adaptation of plasma membrane H+ ATPase of proteoid roots of White Lupin (Lupinus albus L.) under phosphorus deficiency

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die quantitative Beziehung zwischen der H+-Abgabe und der Abgabe von Citrat an aktiven und intakten Proteoidwurzeln in situ aufzuklären. Dabei sollte geklärt werden, wie die beiden Transportprozesse aufeinander abgestimmt sind. Ferner sollte herausgearbeitet werden, ob eine Beteiligung der Plasmalemma-H+-ATPase von Proteoidwurzeln festzustellen ist, und ob es einen Adaptionsmechanismus des Enzyms an die P-Mangel-Situation gibt. Die aktiven und intakten Proteoidwurzeln wurden in einer kleinen Küvette mit 3 ml Reaktionslösung inkubiert. Die exsudierten Kationen und Anionen wurden danach gemessen. Das Plasmalemma der Proteoidwurzeln und Seitenwurzeln-Apikalzonen wurden isoliert und die Plasmalemma-H+-ATPase wurde auf biochemisch, proteinchemisch und auf molekularer Ebene untersucht. 1. In situ steht die H+-Abgabe durch aktive Proteoidwurzeln in Beziehung zur Citratabgabe (Stöchiometrie 1:1,3 - Citrat : H+). Eine vergleichbares Verhältnis besteht auch zwischen Citratabgabe und Abgabe von K+, Na+ und Mg2+. 2. Studien mit verschiedenen Inbibitoren in situ zeigten eine engere Beziehung zwischen H+-Abgabe und Citratabgabe durch Proteoidwurzeln. Jedoch ist die H+-Abgabe nicht die Voraussetzung für die Citratabgabe. 3. Die Aktivität der Plasmalemma-H+-ATPase in aktiven Proteoidwurzeln erhöht sich während der Proteoidwurzelentwicklung signifikant, und erreicht ihr Maximum im reifen Stadium. Im seneszenten Stadium erfolgt ein rascher Rückgang der Aktivität. 4. Eine höhere Aktivität der Plasmalemma-H+-ATPase ist auf eine höhere Enzym-konzentration der H+-ATPase im Plasmalemma zurückzuführen. 5. Eine höhere Enzymkonzentration der Plasmalemma H+-ATPase ist auf eine hochregulierte Expression der mRNA der H+-ATPase zurückzuführen. 6. Die Ergebnisse bekräftigen die Hypothese, dass H+ und Citrat über unterschiedliche Transportproteine im Plasmalemma pflanzlicher Zellen exportiert werden. 7. In Bezug auf Gen-Expression sind PEPC, ATP-Citrat-Lyase und Plasmalemma-H+-ATPase wichtige Enzyme, die in enger Beziehung zur Citrate-Abgabe durch aktive Proteoidwurzeln stehen.

White lupin (Lupinus albus L.) is able to adapt to phosphorus deficiency by forming proteoid roots that release a huge amount of citrate and protons. In the present study, the mechanisms underlying citric acids release from proteoid roots of white lupin were studied at different levels, from intact roots in situ, enzyme characterization on membrane viscles in vitro, identification and quantification of H+ ATPase at protein level, to the gene expression at transcription level. The data obtained support the following conclusions: 1. In situ,. H+ release by active proteoid roots is related to citrate release with a stoichimetry of 1:1.3 (citrate : H+). A comparable stoichimetry between citrate release and release of K+, Na+ and Mg2+ was also determined. 2. Studies with different pharmacological drugs reveal a closely relationship between citrate release and H+ release from proteoid roots. However, H+ release is not the prerequisite for citrate release. 3. The activity of plasma membrane H+ ATPase in active proteoid roots is significantly increased during the development of proteoid roots and reaches a maximum at mature stage (5-6 d after emergency), and declines rapidly at senescent stage (8 d after emergency). This matches the time course of H+ and citrate exudation by intact proteoid roots. 4. Increased activity of plasma membrane H+ ATPase is attributed to the enhanced enzyme concentration in the plasma membrane of active proteoid roots. 5. An up-regulation of the mRNA of plasma membrane H+ ATPase is responsible for the higher enzyme concentration in active proteoid roots (proteoid roots at mature stage). 6. The data support the hypothesis that exudation of citric acid is attributed to transport processes across plasma membrane: H+ export by H+ ATPase, and citrate export by anion channel-like transporters. 7. According to gene expression, PEPC, ATP-dependent citrate lyase and plasma membrane H+ ATPase are important enzymes, which are closely related to citric acid release by proteoid roots, and therefore should be considered as target enzymes for a genetic approach to create P-efficient crops.