Peroxisomes in endocrine pancreatic islets, possible protectors against lipotoxicity?

Abstract

Type 2 diabetes is characterized by impaired insulin secretion paralleled by a progressive decline in ß-cell function and chronic insulin resistance. The failure in ß-cell function has been attributed to the deleterious effect of chronically elevated levels of glucose and fatty acids. These processes, known as glucolipotoxicity, are related to the generation of chronic oxidative stress and the alteration of the intracellular energy metabolism in pancreatic ß-cells.Peroxisomes are organelles involved in the degradation of a variety of lipid derivatives and in the metabolism of reactive oxygen species. To date, scarce information is available concerning the function of peroxisomes in pancreatic ß-cells, however, the abundance of this organelle in the pancreatic endocrine region suggests that the metabolic function of peroxisomes might be particularly relevant to ß-cell function. Therefore, we investigated whether the dysfunction of peroxisomes is involved in oxidative stress and intracellular lipid accumulation which in turn results in ß-cell dysfunction and death.Therefore, the main goal of this thesis was to analyse the role of peroxisomes in maintaining normal ß-cell physiology and protecting ß-cells against glucolipotoxicity induced by palmitic and phytanic acid.To this end, a peroxisomal dysfunction was induced in ß-TC3 cells by siRNA-mediated Pex13 and Abcd3 knockdown. To obtain an integral overview on the peroxisomal compartment and its enzyme composition and to analyse the molecular consequences of peroxisome deficiency as well as the induced glucolipotoxicity in the pathology of ß cells, total RNA isolation, qRT-PCR, Western blot, immunofluorescence analysis, catalase-assay, reactive oxygen species indirect measurements, laser capture microdissection and lipid droplet accumulation analysis were carried out. Further, we also assessed the capability of the ß-TC3 cells to store/secrete insulin after the induced peroxisomal defect and lipid overload.The results in this thesis stress the importance of functional peroxisomal metabolism for the detoxification of excess FA in ß-cells. Our findings support the notion that peroxisomal dysfunction, here achieved by the silencing of Pex13, leads to an increased intracellular H2O2 production and causes mitochondrial alterations in ß-TC3 cells. Furthermore, the peroxisomal dysfunction (alone or in combination with toxic lipid concentrations) alters the lipid storage capability of ß-cells.Novel evidence of the toxicity of PHY for the ß-cell (which was exacerbated by the Pex13 knockdown) was presented, which was accompanied by a decrease in insulin biosynthesis. We showed a rise in the formation of H2O2 production after PA treatment together with an increase in catalase expression and activity suggesting a positive-feedback to re-establish the redox homeostasis that was disturbed by the addition of the FA. Moreover, the treatment with PA and the Pex13 silencing (but not PHY treatment) resulted in alterations of ß-cell-specific genes involved in ß-cell function and identity (Pax6, Pax4 and Pdx1).Further elucidation of the role of this organelle in ß-cell function and disease might bring new research opportunities to find new targets and strategies in the treatment and prevention of diabetes. Typ 2 Diabetes ist durch eine beeinträchtigte Insulinsektetion mit einem kombinierten Verlust der ß-Zellen und einer chronischen Insulinresistenz charakterisiert. Dieser Verlust der Funktionalität von ß-Zellen wird einer chronisch erhöhten Konzentration von Glucose und Fettsäuren zugeschrieben. Dieser Prozess, bekannt als Glucolipotoxizität, steht im Zusammenhang mit oxidativem Stress und verändertem Energie-Metabolismus in pankreatischen ß-Zellen.Peroxisomen sind Organellen, die beim Abbau von Fettsäureabkömmlingen und oxidativem Stress beteiligt sind. Bis heute stehen nur wenige Informationen über die Funktion der Peroxisome in pankreatischen ß-Zellen zur Verfügung, obwohl die hohe Anzahl dieser Organellen im endokrinen Pankreas eine wichtige Rolle in deren Funktionalität nahelegt. Daher untersuchten wir, ob eine beeinträchtige Funktion von Peroxisomen zu verändertem oxidativem Stress und intrazellulärer Fettakkumulation führt, welche wiederum zu Schädigungen der Zellphysiologie bzw. Zelltod führt.Daher war das Hauptziel dieser Arbeit die Rolle von Peroxisomen in der Aufrechterhaltung eines normalen Stoffwechsels in der ß-Zelle und dem Schutz vor oxidativem Stress von Glucolipotoxizität, induziert durch Phytansäure und Palmitinsäure, zu analysieren.Um dies zu untersuchen, haben wir eine peroxisomale Fehlfunktion durch ein siRNA- induziertes Knockdown der Gene für Pex13 und Abcd3 herbeigeführt. Um sowohl eine Übersicht über die Verteilung und die Enzymfunktion von Peroxisomen, als auch eine Analyse über die molekulären Konsequenzen einer Fehlfunktion und der Glucolipotoxizität zu erhalten, haben wir zum einen RNA isoliert, Western blots, Immunofluoreszenzen und Katalase analysiert, und zum anderen ROS indirekt gemessen, Laser-Mikrodissektionen durchgeführt und die Verteilung von Fetttröpfchen in der ß-Zelle untersucht. Darüber hinaus haben wir die Fähigkeit der ß-Zelle zur Speicherung und Sekretion von Insulin, nach vorrausgegangener induzierter Fehlfunktion von Peroxisomen bzw. Fettüberladung, untersucht.Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die wichtige Rolle der korrekten Funktion des peroxisomalen Metabolismus für die Detoxifizierung von überschüssigen Fettsäuren in ß-Zellen.Unsere Resultate unterstützen weiterhin die Auffassung, dass peroxisomale Fehlfunktion, die hier durch das beeinträchtigen des Pex13-Gens herbeigeführt wurde, zu einer erhöhten intrazellulären H2O2 Produktion führt und dadurch die Mitochondrien in ß-TC3 Zellen beeinflusst. Außerdem führt die Fehlfunktion von Peroxisomen (alleine oder in Kombination mit toxischen Fettsäurekonzentrationen) zu einer veränderten Speicherfähigkeit von Fett in ß-Zellen.Neue Evidenz für die Toxizität von PHY für die ß-Zelle (welche durch ein Pex13 Knockdown verstärkt werden konnte) mit einer einhergehenden Reduktion der Insulinsynthese konnte erzeugt werden. Wir zeigten einen Anstieg in der H2O2 Produktion, gefolgt von einer erhöhten Katalase Expression und Aktivität nach Behandlung der Zellen mit PA, was auf ein positives Feedback hinweist, dass wahrscheinlich die durch Fettsäuren veränderte Redox- Homeostase wiederherstellen soll. Abschließend zeigten wir, dass eine Behandlung mit PA (aber nicht mit PHY) und ein Knock-Down des Pex13 Gens in einer veränderten Expression in ß-Zell spezifisches Genen für peroxisomale Funktion bzw. Integrität (Pax6, Pax4 and Pdx1) mündet.Weitere Untersuchungen über die Rolle dieses Organells in der Funktion von ß-Zellen, wie auch dessen Krankheiten könnten zu neuen Forschungsansätzen, und damit zu neuen Strategien in der Bekämpfung bzw. der Prävention von Diabetes, führen.