Biochemische und molekularbiologische Studien zum Melaninabbau mittels versatiler Peroxidase aus Irpex consors

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2017

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10438

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In der vorliegenden Arbeit konnten sieben Basidiomyceten identifiziert werden, welche in der Lage waren, Melanin in Agarplatten abzubauen. Der Basidiomycet mit der höchsten Peroxidaseaktivität, Irpex consors, wurde ausgewählt und in weiteren Studien untersucht. Durch Submerskultivierung von Irpex consors wurde Kulturüberstand gewonnen, welcher mehreren Reinigungsschritten unterzogen wurde. Nach Ammoniumsulfatfällung, Filtrierschritten und zweistufiger FPLC-Reinigung mit einem schwachen Anionentauscher sowie mit Größenausschlusschromatographie konnte das Zielenzym isoliert werden. Die molekulare Masse wurde mittels denaturierender SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung zu 47 kDa ermittelt. Der isoelektrische Punkt wurde mittels isoelektrischer Fokussierung mit nachfolgender Coomassie- und ABTS-Aktivitätsfärbung zu 3,5 bestimmt. In den Untersuchungen zur Enzymcharakterisierung wurde ein pH-Optimum von 3,6, eine optimale Umsetzungstemperatur von 50 °C, sowie eine optimale Wasserstoffperoxidkonzentration von 35 µM bestimmt. Durch tryptischen Verdau und anschließende MALDI-TOF-MS/MS wurde das Enzym identifiziert. Es wurde als eine beim Ligninabbau durch Imami et al. (2015) bereits untersuchte versatile Peroxidase identifiziert. Der N-Terminus der publizierten Aminosäurensequenz wurde mittels Edman-Abbau verifiziert.Die Peroxidaseaktivität im Kulturüberstand von Irpex consors wurde mit verschiedenen Substraten wie Melanin, der Calcium-Sulfitablauge BretaxCl, Vanillin, Oxalsäure, Gallussäure, Dimethoxyphenol, Veratrylalkohol und Ferulasäure induziert. Die Induktion der Peroxidaseproduktion durch das Substrat Melanin wurde auf molekularbiologischer Ebene durch RT-qPCR über Berechnung anhand dreier Referenzgene nachgewiesen.Ein 2-Enzym-System wurde etabliert, bei welchem Wasserstoffperoxid kontinuierlich in-situ durch eine Glucoseoxidase produziert wurde. Die Parameter des 2-Enzym-Systems wurden optimiert und erfolgreich auf Melaninabbau in einem Modellsystem übertragen. Durch dieses 2-Enzym-System wurde Melanin deutlich effektiver abgebaut als durch Zugabe von Wasserstoffperoxid.Die Analyse des Substratspektrums der versatilen Peroxidase erfolgte mit den natürlichen Farbstoffen Bixin, Indigokarmin, Curcumin und & #946;-Carotin, welche von der versatilen Peroxidase erfolgreich umgesetzt wurden. Die flüchtigen, aromarelevanten Abbauprodukte von & #946;-Carotin wurden mittels head-space solid phase micro extraction (HS-SPME) sowie mittels stir bar sorptive extraction (SBSE) extrahiert und anschließend gaschromatographisch-massenspektrometrisch untersucht. Dabei wurden die Abbauprodukte & #946;-Ionon, & #946;-Cyclocitral, 5,6-Epoxy-& #946;-ionon und Dihydroactinidiolid identifiziert.Quantifizierungen der Abbauprodukte & #946;-Ionon und & #946;-Cyclocitral erfolgten durch Ermittlung des Responsefaktors des verwendeten internen Standards Thymol.

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