Mechanismus Hypoxie-induzierter Permeabilitätsveränderungen am in vitro Modell der Bluthirnschranke
Nach Bestätigung der unbeeinträchtigten Viabilität der Zellen post 24 stündiger Hypoxie, konnte ein signifikanter Permeabilitätsanstieg unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu Kontrollkulturen über den parazellulären Weg nachgewiesen werden. Dieser Transportweg wurde daraufhin hinsichtlich der Expression des Tight Junction Proteins ZO-1 in microvasculären Hirnendothelzellen vom Schwein (BMEC), RBE4- und CSG-Zellen näher untersucht. Dabei wurde eine veränderte Expressionslokalisation dieses Proteins nach 24 stündiger Hypoxie sichtbar. Nachweislich war diese Veränderung bei allen verwandten Endothel- und Epithelzellen sichtbar. In weiterführenden Untersuchungen, die eine Beteiligung zytoskeletaler Elemente an diesen Veränderungen fokussierten sollten, konnten im Hinblick auf die F-Aktin Expression bei allen verwendeten Zelllinien nur leichte Veränderungen im Sinne einer Streßfiberbildung nachgewiesen werden, wobei der quantitativ bestimmte F-Aktin Gehalt unverändert war. Da hypoxiebedingte Permeabilitätsveränderungen häufig durch unter hypoxischen Bedingungen gebildetes VEGF hervorgerufen werden, sollte dessen Einfluß hinsichtlich einer veränderten ZO-1 Expression unter hypoxischen Bedingungen untersucht werden. Nach Zugabe eines polyklonalen Antikörpers gegen VEGF konnten die beschriebenen Veränderungen vollständig verhindert werden, was für BMEC-, RBE4- und CSG-Zellen gezeigt werden konnte. Somit scheint das unter Einfluß von Hypoxie gebildete VEGF die Permeabilität des Zellmonolayers über den parazellulären Weg zu erhöhen. In weiterführenden Untersuchungen konnte ein Zusammenhang zwischen der Wirkung des VEGF und hypoxischen Bedingungen bestätigt werden, da die Zugabe von VEGF zu normoxischen Kulturen keine Veränderungen hervorrief, wohingegen unter Zusatz von VEGF und Antioxidantien zu normoxischen Kulturen ebenfalls eine veränderte Expression des ZO-1 auftrat. Westernblotanalysen zeigten keine Veränderungen der Proteinexpression des ZO-1 zwischen den unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen inkubierten BMEC- und CSG-Zellen. Allerdings konnte nach Ablauf von 24 stündiger Hypoxie eine erhöhte Phosphorylierung des ZO-1 sowohl bei BMEC als auch bei CSG nachgewiesen werden, die durch einen Antikörper gegen VEGF verhindert werden konnte, wie in BMEC-Kulturen gezeigt wurde. Es zeigt sich, daß VEGF an der Phosphorylierung des ZO-1 unter hypoxischen Bedingungen beteiligt ist. In Kokulturversuchen mit Astrozyten und C6-Zellen zeigte sich bereits unter normoxischen Bedingungen eine geringere Permeabilität als bei den Kontrollkulturen ohne Kokultur. Unter hypoxischen Bedingungen wurde der Permeabilitätsanstieg sowohl von Astrozyten als auch von Gliomazelleneindrucksvoll verhindert. In sich anschließenden immunhistochemischen Versuchen wurde den BMEC-Zellen konditioniertes Medium von C6-Gliomazellen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen für die Dauer von 24 Stunden zugesetzt. Tatsächlich konnten die vorher unter Hypoxie nachweisbaren Veränderungen im Sinne einer veränderten ZO-1 Expression nun nicht mehr nachgewiesen werden.
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