A twostep affinity purification of nuclear mRNPs

Abstract

Die Genexpression ist ein hochkomplexer und streng regulierter Prozess, bei dem die Boten-RNA (mRNA) vom Zellkern ins Zytoplasma transportiert und dort übersetzt wird. Ein wichtiger Schritt der Genexpression ist die Bildung eines Komplexes aus einer mRNA und vielen Proteinen , welcher mRNP genannt wird. Ein in S. cerevisiae konservierter Proteinkomplex TREX ist neben der Synthese und dem Export von mRNA auch an der Bildung dieser mRNPs beteiligt. Obwohl in Hefe viele RNA bindende Proteine (RBPs) untersucht sind, ist die Zusammensetzung und die Struktur der nuklearen mRNPs bis heute unbekannt. Da beim Menschen einige Arten von Krebs und neurologische Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ihren Ursprung in der Fehlregulation von Proteinen haben, welche an der mRNP Formation beteiligt sind, ist es essenziell, den Prozess der mRNP Formation in Hefe zu studieren und dieses Wissen auf die menschliche Genexpression zu übertragen. Zur Untersuchung der mRNP Formation in Hefe stellt diese Studie ein Reinigungsprotokoll für nukleare mRNPs vor. Das Ziel ist die Reinigung eines spezifischen nuklearen mRNP. Das Wort spezifisch beschreibt, dass nur Kopien eines mRNPs von einer zuvor ausgewählten mRNA aus dem Zellextrakt gereinigt werden. Im ersten Schritt werden alle nuklearen mRNPs über eine Affinitätsreinigung angereichert. Dies geschieht über die Selektion nach der 5‘ Kappe der mRNAs. Im nächsten Schritt wird die mRNA von CCW12 oder ILV5, deren mRNPs gereinigt werden sollen, durch einen biotinylierten 2'-O methylierten Antisense-Oligonukleotid erkannt und gebunden. Zur Verbesserung der Reinigung wurden unterschiedliche Inkubationszeiten und Temperaturen, sowie verschiedene Puffer getestet. Um die Auswirkung der Änderung auf die Reinigung zu untersuchen, wurden die mRNA Level mit qPCR bestimmt und die aufgereinigten Proteine auf Western Blot analysiert. Des Weiteren wurden die gereinigten mRNP Komplexe unter dem Elektronen Mikroskop (EM) untersucht. Es wurden Partikel gefunden, die in Form und Größe den Voraussagen für CCW12 mRNPs in der Literatur entsprechen. Das hier veröffentlichte Protokoll kann zur Reinigung jedes spezifischen nuklearen mRNP verwendet werden. Die gereinigten Proben dienen der weiteren Charakterisierung des mRNP. Dazu zählen unter anderem die Bestimmung der Masse, der Struktur und die Ladung des Komplexes. Das Verständnis der mRNP Formation und das Wissen über jeden Zustand des Komplexes während seien Lebens-Zyklus liefert möglicherweise Antworten auf die Frage, warum Proteine, die für die mRNP Formation beim Menschen verantwortlich sind, zur Ausprägung diverser Krebsarten und neurologischer Krankheiten beitragen.