Annotation, phylogenetic analysis and functional characterization of barley [Hordeum vulgare L] WRKY transcription factors in the interaction with powdery mildew fungus Blumeria graminis

Abstract

WRKY transcription factors are a conserved superfamily distributed in eukaryotes and extremely expanded in flowering plants. They are central regulators of diverse plant cellular responses such as biotic and abiotic stresses. Despite the economic importance of the crop plant barley (Hordeum vulgare L.) and the significance of WRKY transcriptional network, the barley WRKY transcription factors are largely understudied and undetermined. The present work aimed to perform a whole-genome gene discovery of barley WRKY family and functionally characterize two of the important genes HvWRKY1 and HvWRKY2 in the interaction with barley powdery mildew fungus Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh).Based on the NCBI databases and the draft sequence of barley genome, blastp, blastn and tblastn searches were performed to find putative barley WRKY sequences. As a result, 100 unique WRKY members containing at least one WRKY domain were found in the barley genome. Apart from the previously annotated 45 HvWRKY members, the novel sequences were designated HvWRKY47-HvWRKY102. Expansion of group III members was found in barley compared with the model plant Arabidopsis thaliana. Within the group III members, WRKYs with a non-canonical WRKYGEK motif were proven to be a monocot-specific group and this diversification implicates special functions in monocot plants. Using artificial microRNA-based transient silencing of HvWRKY2, I observed on single-cell level enhanced resistance to Bgh. Together with previous findings this result confirmed its nature as negative regulator in barley-Bgh interaction. Whereas the R-protein Mla10 was identified as an upstream factor for HvWRKY1 and HvWRKY2, downstream target promoters are unknown for barley WRKYs. HvGER4c is one of the most abundant pathogenesis-related (PR) genes induced in Bgh-infected barley leaf epidermal cells and contains enriched WRKY-binding sites in the promoter. The wild-type and W-box mutated versions of HvGER4c promoter GUS fusion constructs were used in the co-bombardment assay with 35S::HvWRKY1/2 plasmids to verify their possible interaction. Co-expression of 35S::HvWRKY1/2 constructs with pHvGER4c::GUS significantly and specifically suppressed the Bgh-induced activity of HvGER4c promoter, with HvWRKY2 showing stronger repression activity than HvWRKY1. The finding indicates a negative transcriptional regulation of HvWRKY1/2 on the defense-related gene HvGER4c. In addition, it was observed that the HvWRKY2-mediated repression of HvGER4c was independent of Mla12 or Mlo, which were previously identified as an effector-dependent interaction partner of HvWRKY1/2, or assumed to be required for HvWRKY2-mediated compatibility respectively. Moreover, electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to analyze the binding of HvWRKY2 recombinant protein with W-box elements in HvGER4c promoter. HvWRKY2 protein showed binding affinity to all the tested W-boxes but with questionable specificity. Transient overexpression of the Arabidopsis homologue AtWRKY40 resulted in enhanced susceptibility to Bgh in barley. The retained activity of AtWRKY40 between dicot and monocot indicated evolutionary conserved functions of IIa WRKY factors as negative regulators in basal defense. Taken together, HvWRKY1 and HvWRKY2 act as negative regulators largely dependent on their transcriptional repression of the downstream target genes, including the verified HvGER4c gene. Some further candidate WRKY genes involved in plant immune responses were suggested based on the microarray expression profile after pathogen challenge. Whole-genome annotation and phylogenetic analysis of barley WRKY transcription factors might provide insights into further characterization and cross-species comparison of the conserved family. Die konservierte Superfamilie der WRKY Transkriptionsfaktoren findet sich in Eukaryoten, besonders in blühenden Pflanzen ist diese Gruppe sehr ausgedehnt. In Pflanzen sind WRKY Transkriptionsfaktoren zentrale Regulatoren von verschiedenen zellulären Antworten, zum Beispiel auf biotischen und abiotischen Stress. Trotz der ökonomischen Bedeutung von Gerste (Hordeum vulgare L.) und der zentralen Rolle des WRKY- Transkriptionsnetzwerks sind die Gersten-WRKY-Transkriptionsfaktoren kaum erforscht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung der WRKY- Familie aus dem gesamten Gerstengenom und die funktionelle Charakterisierung von zwei bedeutsamen Genen, HvWRKY1 und HvWRKY2, in der Interaktion mit dem Gerstenmehltau Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh).Unter Nutzung der Datenbanken des NCBI und der vorläufigen Sequenzierung des Gerstengenoms wurde eine Suche mit den Programmen blastp, blastn und tblastn durchgeführt, um putative WRKY-Sequenzen der Gerste zu finden. Es konnten 100 einzelne WRKY- Mitglieder mit mindestens einer WRKY- Domäne im Gerstengenom identifiziert werden. Neben 45 bereits annotierten Mitgliedern der HvWRKY-Gruppe wurden die neuen Sequenzen als HvWRKY47 bis HvWRKY102. Die Gruppe III der WRKY Transkriptionsfaktoren ist in Gerste im Vergleich zu der Modellpflanze Arabidopsis thaliana erweitert. Es konnte gezeigt werden, dass die innerhalb der Gruppe III identifizierten WRKYs mit einem nicht-kanonischen WRKYGEK-Motiv eine spezielle Gruppe bei Monokotylen darstellen. Diese Erweiterung deutet auf spezielle Funktionen in monokotylen Pflanzen hin. Die transiente Ausschaltung von HvWRKY2 mittels artifizieller microRNA führte zu einer erhöhten Resistenz gegenüber Bgh auf Einzelzellebene. Zusammen mit früheren Erkenntnissen bestätigte diese Beobachtung die Eigenschaft von HvWRKY2 als negativer Regulator in der Gersten-Bgh-Interaktion. Während das R-Protein Mla10 als vorgeschalteter Faktor von HvWRKY1 und HvWRKY2 bereits bekannt ist, konnten nachgeschaltete Ziel-Promotoren für Gersten-WRKYs bisher nicht gefunden werden. HvGER4c ist eines der am stärksten induzierten Pathogenese-assoziierten Gene (pathogenesis-related genes, PR-Gene) in Bgh-infizierten Epidermiszellen der Gerstenblätter. Das HvGER4c-Gen hat in seinem Promotorbereich eine Anreicherung von WRKY-Bindungsstellen. Deshalb wurden Wildtyp- sowie W-Box-mutierte Versionen von HvGER4c-Promotor-GUS-Fusionskonstrukten in einer Co-Bombardement-Untersuchung mit 35S::HvWRKY1/2 Plasmiden getestet, um eine mögliche Interaktion zu prüfen. Die Co-Expression von 35S::HvWRKY1/2 Konstrukten mit pHvGER4c::GUS unterdrückte signifikant und spezifisch die Bgh-induzierte Aktivität des HvGER4c-Promotors. Hierbei zeigte HvWRKY2 eine stärkere Unterdrückung als HvWRKY1. Dieses Ergebnis deutet auf eine negative transkriptionelle Regulation des Abwehr-assoziierten Gens HvGER4c durch HvWRKY1/2 hin. Zusätzlich konnte beobachtet werden, dass die HvWRKY2-vermittelte Repression von HvGER4c unabhängig von Mla12 oder Mlo ist, welche bereits als Effektor-abhängige Interaktionspartner von HvWRKY1/2 identifiziert wurden oder die als notwendig für die HvWRKY2-vermittelte Kompatibilität angesehen werden. Des Weiteren wurde eine EMSA-Untersuchung (EMSA = electrophoretic mobility shift assay) durchgeführt, um die Bindung von HvWRKY2 rekombinantem Protein mit W-box-Elementen des HvGER4c Promotors zu studieren. Das HvWRKY2 Protein zeigte Bindungsaffinität zu allen getesteten W-Boxen, jedoch konnte die Spezifität nicht abschließend geklärt werden.. Die transiente Überexpression des Arabidopsis- Homologs AtWRKY40 in Gerste führte zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Bgh. Die Aktivität von AtWRKY40 sowohl in dikotylen als auch in monokotylen Pflanzen deutet auf evolutionär konservierte Funktionen von IIa WRKY- Faktoren als negative Regulatoren in der basalen Abwehr hin. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass HvWRKY1 und HvWRKY2 als negative Regulatoren zur transkriptionellen Unterdrückung von nachgeschalteten Zielgenen führen, eingeschlossen das überprüfte HvGER4c-Gen. Einige weitere WRKY Kandidaten-Gene, die an der pflanzlichen Immunantwort beteiligt sind, konnten anhand von Expressionsprofilen nach Pathogenbefall identifiziert werden. Die vorgenommene WRKY-Annotation basierend auf dem vorläufig identizierten Gersten-Genom und die phylogenetische Analyse von Gersten- WRKY-Transkriptionsfaktoren können weitere Erkenntnisse für die Charakterisierung und Art-übergreifende Vergleiche dieser konservierten Familie liefern.