Molekulare Charakterisierung von c-Typ- und i-Typ-Lysozymen des Asiatischen Marienkäfers Harmonia axyridis

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2015

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10346

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Der Asiatische Marienkäfer Harmonia axyridis (PALLAS, 1773) ist durch seine weltweiten Einwanderungserfolge in den letzten Jahren als Model-Organismus der Invasionsbiologie hervorgetreten. Der ursprünglich in Ostasien beheimatete Marienkäfer wurde als höchst wirksamer Prädator von Blatt- und Schildläusen zur biologischen Schädlingsbekämpfung in Nordamerika und teilen Europas eingeführt und hat sich heutzutage unkontrolliert über die eingeführten Gebiete hinaus bis nach Südamerika und Afrika ausgebreitet. Dieser Invasionserfolg ist unter anderem der ausgeprägten Immunabwehr von H. axyridis zuzuschreiben, die durch ein zweilagiges Immunsystem einen herausragenden Schutz gegen Pathogene bietet. Dieses zweilagige Immunsystem besteht aus der konstitutiv synthetisierten nieder-molekularen antimikrobiellen Substanz Harmonin und induzierbaren antimikrobiellen Peptiden, deren Expression nach erfolgter Infektion hochreguliert wird. Eine wichtige Klasse der antimikrobiellen Peptide sind die zu den hydrolytischen Enzymen zählenden Lysozyme. Bei einer Transkriptomanalyse konnten unter anderem 9 für Lysozyme kodierende Sequenzen in H. axyridis identifiziert werden, wovon 4 der Subklasse der c-(chicken)-Typ-Lysozyme und 5 der i-(invertebrate)-Typ-Lysozyme zuzuordnen sind. Während i-Typ-Lysozyme von Anneliden und Mollusken bifunktionale Enzyme sind, die sowohl eine Isopeptidase-Aktivität als auch eine Muramidase-Aktivität aufzeigen, besitzen die c-Typ-Lysozyme ausschließlich eine Muramidase-Aktivität. Es ist bekannt, dass c-Typ-Lysozyme von Insekten abhängig von der vorliegenden Aminosäuresequenz eine Muramidase-Aktivität aufweisen können, allerdings existieren keine Untersuchungen von i-Typ-Lysozymen aus Insekten. Aus diesem Grund untersuchte die vorliegende Arbeit drei von den vier c-Typ-Lysozymen (c-Lys2, c-Lys3 und c-Lys4) sowie ein i-Typ-Lysozym (i-Lys2) mit Hinblick auf konservierte, katalytische Aminosäurereste, die relevant für eine Muramidase- oder Isopeptidase-Aktivität sind. Sowohl die c-Typ-Lysozyme als auch das i-Typ-Lysozym wurden mit einem c-terminalen His6-Tag modifiziert in der eukaryotischen Hefe Pichia pastoris rekombinant hergestellt und mittels HPLC aufgereinigt. C-Lys2, welchem die katalytischen Aminosäurereste Glu und Ala fehlten, besaß keine Muramidase-Aktivität, während für c-Lys3 und c-Lys4 eine Muramidase-Aktivität gezeigt werden konnte. Die letztgenannten unterschieden sich in ihren theoretischen isoelektrischen Punkten (c-Lys3, pI = 5,46; c-Lys4, pI = 8,18), allerdings lag das pH-Optimum von beiden Lysozymen im leicht sauren pH-Bereich. Weiterhin konnte für beide aktiven c-Typ-Lysozyme eine Calcium-Abhängigkeit gezeigt werden, welche mit dem Vorhandensein einer Asp-reichen Domäne einhergeht. Dieses Sequenzmotiv ist bekannt dafür, dass es eine wichtige Rolle bei der Calcium-Bindung spielt, was bisher nicht auf enzymatischer Ebene für Lysozyme gezeigt wurde. Das rekombinante i-Typ-Lysozym war gegenüber dem Muramidase-Substrat als auch dem Isopeptidase-Substrat inaktiv. Immunhistochemische Färbung und eine Expressionsanalyse mit verschiedenen Organen von H. axyridis ergaben, dass das i-Lys2 im Fettkörper exprimiert und lokalisiert ist. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass i-Typ-Lysozyme eine noch nicht bekannte Funktion in Insekten einnehmen. Mittels Immunstimulation der Käfer durch Injektion von Bakterien konnte eine 8-fache Hochregulation des c-Lys4-Gens im Darm gezeigt werden, während die Expression von c-Lys3 und i-Lys2 durch Immunstimulation nicht beeinflusst wurde. Weiterhin zeigten weder die rekombinanten c-Typ-Lysozyme c-Lys3 und c-Lys4 noch das i-Lys2 eine antimikrobielle Aktivität gegen zahlreiche getestete Mikroorganismen. Allerdings konnte in einem Bacillus subtilis Wachstumsinhibitionstest die antimikrobielle Aktivität von Harmonin und zwei induzierbaren Ceoloptericinen, die zu AMPs zählen, durch die Zugabe von c-Lys4 verstärkt werden. Die minimalen Inhibitionskonzentrationen verringerten sich nach der Zugabe von c-Lys4 bei Harmonin um das 4-fache und bei den AMPs um das 16-fache. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass zumindest ein katalytisch aktives Lysozym (c-Lys4) Teil des hoch effizienten Immunsystems ist, welches ein wichtige Rolle bei der erfolgreichen Invasion von H. axyridis einnimmt.

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