Molekulare und funktionelle Charakterisierung des Calciumregulators SLC10A7

Abstract

SLC10A7 wird aufgrund seiner Sequenzhomologie der Familie der Gallensäuretransporter (SLC10) zugeordnet, obwohl es sich von diesen funktionell abgrenzt. Phylogenetisch kommt SLC10A7 in unterschiedlichsten Tierklassen hochkonserviert vor. Für den Menschen werden sieben verschiedene Transkriptvarianten beschrieben, von denen hauptsächlich die Transkriptvarianten 2 und 4 in einem breiten Gewebespektrum exprimiert werden. In funktionellen Fluo-4 Calciummessungen zeigte sich, dass die SLC10A7-Proteinexpression negativ mit dem Calciumeintritt über speichergesteuerte Calciumkanäle (SOCE) korreliert. SLC10A7-Knockout-Hap1 Zellen zeigten höhere zytoplasmatische Calciumkonzentrationen nach Behandlung mit SOCE-anregenden Substanzen wie Thapsigargin, Ionomycin und ATP + Carbachol; ein gegenteiliger Effekt war für SLC10A7-überexprimierende HEK293 Zellen zu detektieren. Die meisten der bisher bekannten Patientenmutationen des SLC10A7-Gens verloren den Effekt des Wildtypproteins auf den Calciumeinstrom, nachdem sie im Zellkulturmodell exprimiert wurden und werden deshalb als funktionell inaktiv angenommen. Für genetische SLC10A7-Varianten, die in Online-Datenbanken gelistet sind und die durch bioinformatische Algorithmen ebenfalls als funktionsbeeinträchtigend vorausgesagt werden, ließ sich dieser Effekt bei sechs von sieben Varianten nicht nachweisen, trotz einer dem Wildtypprotein ähnlichen Sortierung ins ER. Fluoreszenzbasierte Colokalisationsstudien zwischen SLC10A7 und an SOCE-beteiligten Proteinen ergaben die höchste Korrelation für STIM, einem ER-ständigen Calciumsensorprotein. Humanes SLC10A7 wird deshalb in dieser Doktorarbeit als Negativregulator des intrazellulären Calciumhaushalts beschrieben, der hauptsächlich über eine Regulation von STIM im ER agieren könnte. Wie genau dies passiert, muss jedoch in weiteren Studien untersucht werden. Eine direkte Interaktion mit ORAI wurde ausgeschlossen. Aussagen bezüglich der Beziehung zu SERCA können nicht getroffen werden, da geeignete Konstrukte für die in vitro Untersuchung in der Zellkultur fehlen. Für die Rolle von SLC10A7 im Prozess der Glykosylierung konnten keine signifikanten Unterschiede in der mRNA Expression der an der N-Glykosylierung beteiligten Proteine MAN1B1, ST6GAL1 und TMEM165 nachgewiesen werden. Das lysosomale Protein LAMP2 aus SLC10A7-Knockout-Zellen zeigte im Vergleich zu Wildtypzellen ein geringgradig verringertes Molekulargewicht im Western Blot, was aufgrund dieses schmalen Effekts auf einen veränderten, späteren Schritt in der Glykosylierungskaskade (wie der Sialylierung) hinweist. Was der Auslöser für diesen dargestellten Effekt ist, muss jedoch in weiteren Experimenten wie einer MS-Analyse der Glykanketten geklärt werden. Auch die veränderte Aktivität verschiedener Mannosidasen bei SLC10A7-Defizienz kann nicht ausgeschlossen werden.