In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Teilprojekte behandelt, die beide zur Aufklärung der strukturellen Natur der aktiven Spezies der apoptotischen Endonukleasen Endonuklease G (EndoG) und Desoxyribonuklease IIalpha (DNase IIalpha), beitragen sollten.
Aus Säugerzellen gewonnene bovine EndoG wurde zuvor bereits weitgehend biochemisch charakterisiert und für das Protein ein Homolgiemodell erstellt. Zu dessen Verifikation wäre es notwendig, Kristallstruktur- oder NMR-spektroskopische Analysen durchzuführen. Um dafür geeignete Proteinpräparationen herzustellen, sollte EndoG in E. coli überexprimiert und gereinigt werden. Da EndoG dabei in inclusion bodies abgelagert wird, wurden in diesem Teil der Arbeit mehrere biochemische Strategien angewandt um aktive EndoG in löslicher Form oder durch Renaturierung aus inclusion bodies zu gewinnen. Expression von EndoG als Fusion mit dem löslichkeitsfördernden Protein NusA führte zu dem Ergebnis, dass sowohl das Fusionsprotein, als auch EndoG nach Abspaltung von NusA durch Thrombin zwar löslich, aber inaktiv waren. In anderen Ansätzen gelang es immerhin durch den Einsatz von Detergenzien in Verbindung mit dem künstlichen Chaperon beta-Cyclodextrin lösliche EndoG aus inclusion bodies zu erhalten, aber keine Präparation des Enzyms verfügte über zufrieden stellende Nukleaseaktivität. Auch ein Matrix-basierter Rentaurierungsversuch unter Verwendung des iFOLDTM-Systems mit 92 verschiedenen, empirisch ermittelten Renaturierungspuffern brachte hier nicht den gewünschten Erfolg.
Zur Charakterisierung des aktiven Zentrums von humaner lysosomaler DNase IIalpha sowie der Beantwortung der Frage, ob die aktive Spezies dieses Enzyms eine dimere oder monomere (pseudodimere) Struktur aufweist, wurde im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit nach erfolgreicher Etablierung eines Expressionssytems in Säugerzellen eine alanine scanning Mutagenese des Enzyms durchgeführt. Es wurden solche Aminosäurereste gegen Alanin ausgetauscht, die in den vorgeschlagenen Modellen, zu den postulierten N- und C-terminalen PLD-Motiven HxK xn-N-xn-(E/Q/D) gehören. Die Ergebnisse des alanine scannings weisen stark darauf hin, daß das katalytische Zentrum der humanen DNase IIalpha von zwei PLD-Motiven gebildet wird, und die aktive Spezies folglich ein Monomer bzw. Pseudodimer ist. Gelfiltrationsanalysen sowie Coimmunopräzipitationsassays mit unterschiedlich Epitop-fusionierten DNase IIalpha-Varianten lieferten darüber hinaus zusätzliche Hinweise auf eine pseudodimere Struktur der aktiven DNase IIalpha.
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