Etablierung einer Methode zur Messung von Nitrat in Serum, Urin und anderen Medien mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Ionenchromatographie

Abstract

Ziel dieser Arbeit war, eine Methode zur Nitratmessung mittels der HPLIC (high pressure liquid ion chromatography) zu etablieren. Anhandvon inhalativer Stickstoffmonoxid(NO)-Gabe bei Kindern mit pulmonalem Hochdruck wurde der Stoffwechsel von NO in vivo untersucht undmit dem bisher klinisch angewandten einzigen Indikator Met-Hb verglichen. Zusätzlich wurden Erythrozyten in vitro mit NO inkubiert.Untersucht wurden die Nitratkonzentrationen im Serum, Urin und in einer Erythrozytensuspension(in vitro). Zudem wurden Normalwerte fürNitrat im Serum und Urin bei Kindern erhoben. Die geringen Probenvolumen von 300µl Serum und 100µl Urin waren von Vorteil.Für die Messung von Nitrat wurde eine Anionenaustauschersäule mit hoher Kapazität und guter chromatographischer Effizienz sowie einLeitfähigkeitsdetektor gewählt. Das Eluens beruht auf einem Borat/Gluconatgemisch mit Acetonitril bei einer niedrigenUntergrundleitfähigkeit von 270µS. Die Retentionszeiten[min] für den internen Standard Chlorat 10,33 ± 0,30 und für Nitrat 11,27 ±0,30. Die Methode ist sowohl in pathologischen als auch physiologischen Bereichen zur Nitratmessung präzise bis 10µmol/l Nitrat.Das asservierte Material kann bei -40°C über mind. 5 Wochen aufbewahrt werden. Zur Proteinabtrennung wurde die Ultrafiltration benutzt.Ein weiterer Extraktionsschritt mit den Sep-Pak-Kartuschen C18 light war zur Auswertung von Serum und Erythrozytensuspensionnotwendig. Die Urinproben konnten jedoch nach einer Verdünnung direkt auf die HPLIC gegeben werden.Durch die inhalative NO-Therapie bei den Patienten konnte gezeigt werden, daß das Stoffwechselendprodukt Nitrat im Blut und im Urinnachweisbar ist. Es kann wie Met-Hb als Indikator für die NO-Gabe gewertet werden. Nitrat spiegelt die NO-Belastung präziser wider. Diein vitro NO-Äquilibrierung der Erythrozytensuspension konnte die enge Korrelation von NO und Nitratentstehung sowie Met-Hb ebenfallssehr gut verdeutlichen. Die etablierte Methode eignet sich nicht nur zur Messung von Nitrat bei exogener NO-Gabe, sondern auch zurNitratmessung bei Sepsis oder gastrointestinalen Infekten i.R. des zu erwartenden endogenen NO-Anstiegs. Die Methode gibt zudemHinweise über die endogene NO-Produktion im physiologischen Bereich, wobei stets andere bisher bekannte Nitratreservoire beachtetwerden sollten.