Einfluss des mTor-Inhibitors der neuen Generation Torin2 auf die Reifung boviner Oozyten

Abstract

Der mehrstufige Prozess der Proteinbiosynthese ist für jede Zelle und somit jedes Lebewesen essentiell. Ab dem frühen Meiosestadium des GVBD-Stadiums bei Eizellen wird die Genexpression nahezu ausschließlich über die Translation vorher transkribierter, gespeicherter RNA kontrolliert. Der mRNA-cap-bindende Komplex eIF4F (bestehend aus dem Gerüstprotein eIF4G, der RNA-Helikase eIF4A und dem mRNA-cap-bindenden Protein eIF4E) ist der zentrale Knotenpunkt der Kontrolle der Translation. Die Formation des Komplexes wird zum einen über Phosphorylierung der Komponenten geregelt und zum anderen über das Bindungsprotein 4E-BP1. Durch die Bindung an eIF4E kann 4E-BP1, dessen Aktivität über den mTor-Signalweg reguliert wird, die Initiation der TL unterdrücken. Um die maturationsspezifische Proteinbiosynthese detallierter zu erforschen, kam im Rahmen dieser Arbeit erstmals bei bovinen Oozyten ein Mitglied einer neuen Gereration der mTor-Inhibitoren, der active-site-mTor-Inhibitor Torin2, zum Einsatz. Die Auswirkungen während der IVM von Rindereizellen durch die Behandlung mit Torin2 wurden morphologisch durch Beurteilung der Kumuluszellexpansion und des Chromatinstatus überprüft. Zudem erfolgte auf biochemischer Ebene eine Analyse der Effekte mittels SDS-PAGE, phos-tag-SDS-PAGE, Western blot und Immunpräzipitationsuntersuchungen. Eine zuvor ermittelte wirksame Konzentration von 3 µM Torin2 im Maturationsmedium führte zu einem irreversiblen Arrest von 60 % der Oozyten im M I-Stadium der Meiose. Die Versuche bewiesen eine effektive, spezifische und reversible Blockade der Rapamycin-insensitiven Phosphorylierung von 4E-BP1 an Thr37/46 ohne Nebeneffekt auf eIF4E oder sämtliche andere Kinasesysteme (MAPK, PKA, PKC, ATM/ATR). Eine herausragende Wirkung auf mTor mit hemmendem Einfluss auf beide mTor-Komplexe, mTorC1 und mTorC2, konnte auf molekularer Ebene nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Stimulation der TL durch die Phosphorylierung von 4E-BP1 für die meiotische Reifung der Eizelle von der M I in die M II notwendig ist. Jedoch scheint die TL dort ein örtlich und zeitlich eng regulierter Vorgang zu sein, da der durch Torin2 verursachte Arrest der Oozyten in der M I bestehen bleibt obwohl sich die 4E-BP1 Phosphorylierung reversibel inhibiert zeigt. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die spezifische Wirkung des active-site-mTor-Inhibitors Torin2 ein gutes Mittel für künftige Forschung im Bereich der Eizellreifung und der frühen Embryonalentwicklung darstellt.