Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen am Hengstejakulat sowie biochemische Analysen des Seminalplasmas
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Zusammenfassung
Die Diagnostik männlicher Fertilitätsstörungen führt häufig zu unbefriedigenden Ergebnissen, da mit den klassischen, vor allem auf der Lichtmikroskopie beruhenden Untersuchungsverfahren ein erheblicher Teil der möglichen Ursachen, insbesondere Störungen der Spermatozoenfunktion, nicht erfasst werden können. Dies trifft auch für den Hengst zu, bei dem schlechte Befruchtungsergebnisse im Vergleich zu anderen Haussäugetierarten relativ häufig vorkommen. Das Beurteilungsspektrum für equine Ejakulate sollte deshalb in der vorliegenden Arbeit durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und biochemische Analysen des Seminalplasmas erweitert werden. Die TEM eignet sich aufgrund ihres hohen Auflösungsvermögens besonders zur detaillierten Darstellung spermien-spezifischer Feinstrukturen, wie Akrosom und Geißel. Ebenso könnten auch biochemische Analysen des Seminalplasmas bezüglich Enzymaktivitäten und Zusammensetzung an Makro- sowie Mikroelementen beim Hengst Hinweise auf das Vorliegen sowie auf mögliche Ursachen einer Pathospermie geben. Ziel der eigenen Arbeit war es daher, zunächst an fertilen Hengsten Referenzwerte für die untersuchten Parameter zu etablieren und dann die getesteten Methoden auf ihre Eignung in der Fertilitätsdiagnostik beim Hengst zu untersuchen. Insgesamt standen Ejakulate von 73 Hengsten für die Untersuchungen zur Verfügung, wobei von 46 dieser Probanden die Fertilität bekannt war. Basierend auf den Befruchtungsergebnissen der vorangegangenen Zuchtsaison wurde eine Klassifizierung der Probanden nach fertil (Konzeptionsraten 70-100 %), subfertil (Konzeptionsraten 10-70 %) und infertil (Konzeptionsraten < 10 %) vorgenommen. Diese Daten wurden dem Untersucher erst nach der Auswertung der Ergebnisse bekannt gegeben. Des Weiteren erfolgte zum Vergleich klassischer Parameter mit Seminalplasmawerten eine Einteilung der Ejakulatproben in die Kategorien normal , geringgradig abweichend und hochgradig abweichend . Geringgradig abweichende Ejakulate wiesen bezüglich eines Parameters leichte und hochgradig abweichende Ejakulate bei mindestens einem der untersuchten Parameter deutliche Deviationen von der Norm auf. Nach Desemination der Hengste wurde unmittelbar im Anschluss eine konventionelle makroskopische, chemisch-physikalische und lichtmikroskopische Ejakulat-untersuchung durchgeführt sowie Seminalplasma durch Zentrifugation des Samens gewonnen. Außerdem wurde ein Spermaaliquot mit 2 % Glutaraldehyd und 0,1 % Pikrinsäure fixiert und für die TEM aufgearbeitet. Zur TEM-Evaluierung wurde jeweils eine im Frühjahr entnommene Samenprobe der 46 Tiere mit bekannten Konzeptionsraten herangezogen. Hierbei erfolgte die Beurteilung von je 200 Akrosomen, Spermienköpfen, Mittelstücken und Geißelquerschnitten sowie 100 Geißellängsschnitten jedes Ejakulates. Für die biochemischen Analysen wurden zu 3 verschiedenen Terminen (Frühling, Sommer, Spätherbst/Winter) Proben gewonnen. Dabei fanden 27 Hengste ausschließlich einmal, 35 Hengste zu zwei Terminen sowie 11 Hengste zu drei Terminen Eingang in die Studie. Bezüglich der biochemischen Analysen wurden die Aktivitäten der Enzyme AST, GLDH, GGT, AP, SP, CK und LDH sowie die Gehalte der Mengenelemente Natrium, Kalium, Kalzium (gesamt und ionisiert), Magnesium, Phosphat und Chlor sowie der Spurenelemente Kupfer, Eisen und Zink ermittelt. Bei den transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen ergab sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen einem erhöhten prozentualen Anteil akrosomaler Deformationen (abgehobene Akrosomen) sowie einer reduzierten Fertilität (p = 0,034; r = - 0,31). Bei fertilen Hengsten war ein geringerer prozentualer Anteil [& #61560;g (SF)] von 4,9 (3,2) % nachweisbar als bei sub- [7,9 (1,9) %] respektive insbesondere infertilen Probanden [11,4 (4,2) %]. Obwohl die Eignung zur Klassifizierung von Hengsten mit unbekannter Fruchtbarkeit hier nicht überprüft wurde, legen die eigenen Ergebnisse den Schluss nahe, dass die TEM-Beurteilung des Akrosoms zur Einstufung der Hengste bezüglich ihrer Fertilität geeignet ist und wichtige Hinweise auf vorliegende Fertilitätseinschränkungen geben kann. Hilfreich ist die TEM ebenfalls zur Abklärung von Infertilitätsfällen unklarer Ätiologie. Neben Spermien konnten in den Ejakulaten Spermatiden und Makrophagen detektiert sowie erstmals beim Hengst mittels TEM verifiziert werden. Ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten dieser Zellen und der Fruchtbarkeit war nicht nachweisbar. Weiterhin gelang im Hengstejakulat eine Erstbeschreibung der sogenannten bizarre forms , einer Ansammlung von Kopf- und Geißelquer- sowie längsschnitten mit einer gemeinsamen umhüllenden Membran, die im Mittel mit 15,0 (2,1) % in den Proben nachweisbar waren. Diese wurden bisher erst bei Rotwölfen erwähnt und werden als eine Entwicklungsanomalie der Spermatozoen diskutiert. Auch die Analysen des Seminalplasmas ermöglichen eine differenzierte Aussage über die Ejakulatqualität. In diesem Zusammenhang sind von den untersuchten Enzymen insbesondere die Laktat-Dehydrogenase (LDH) sowie die Alkalische Phosphatase (AP) und Saure Phosphatase (SP) zu nennen. Hier ließen sich Korrelationen der LDH zur Gesamt- (p = 0,0062, r = 0,3217) und Progressivmotilität (p = 0,0048, r = 0,33), zur Dichte (p = 0,025; r = 0,2694) und zum Volumen (p = 0,009; r = - 0,3079) ermitteln. Für die testikulär und epididymal lokalisierten Enzyme AP und SP konnte ein signifikanter positiver Zusammenhang zur Dichte (p (SP, AP) < 0,0001;r (SP) = 0,4808, r (AP) = 0,6154) verifiziert werden. Dies stützt die Hypothese, dass beide Enzyme eine Eignung besitzen, Auskunft über den vollständigen beziehungsweise unvollständigen Ablauf der Reflexkette zu geben. Die ebenfalls nachgewiesene, negative Beziehung der AP respektive SP zum Volumen (p (SP) = 0,0004, r (SP) = - 0,412; p (AP) < 0,0001, r (AP) = - 0,5696) belegt den bereits postulierten testikulären und epididymalen Ursprung. Bezüglich der Mikroelemente gelang der Nachweis einer signifikanten Beziehung zwischen Fertilität sowie der Zinkkonzentration im Sommer (p = 0,017) und im Spätherbst/Winter (p = 0,048), nicht jedoch im Frühjahr. Weiterhin existierten signifikante Unterschiede der Kupferkonzentration im Seminalplasma zwischen normalen und hochgradig abweichenden Ejakulaten sowie der Eisenkonzentration zwischen normalen und geringgradig abweichenden Ejakulaten, was auf weiterführende diagnostische Einsatzmöglichkeiten hindeutet. Zwischen elektronenmikroskopisch festgestellten spontanen Akrosomenreaktionen und erhöhten Gehalten an ionisiertem Kalzium im Seminalplasma konnte ein Zusammenhang ermittelt werden. Eine Eignung der Kalziumbestimmung für den diagnostischen Einsatz in speziellen Fällen wird anhand eines Hengstes mit deutlich oberhalb des Medians liegender Konzentrationen ionisierten Kalziums im Seminalplasma postuliert, welcher anamnestisch durch reduzierte Haltbarkeit des Ejakulates im Versand und durch einen im Vergleich zu den anderen Probanden relativ hohen Anteil an elektronenmikroskopisch detektierbaren Akrosomenreaktionen auffiel. Insgesamt stellte sich die TEM im Rahmen dieser Untersuchungen als geeignete Methode zur Fertilitätsdiagnostik heraus, die in speziellen Fällen ergänzend und auch zur ätiologischen Abklärung Anwendung finden sollte. Insbesondere aufgrund des Nachweises einer deutlichen Korrelation zwischen Fertilität und prozentualem Anteil abgehobener Akrosomen stellt die TEM eine wertvolle Erweiterung des derzeitigen Methodenspektrums zur Beurteilung equiner Ejakulate in Bezug auf die Befruchtungsfähigkeit dar. Auch die Analysen des Seminalplasmas sind somit im Rahmen der erweiterten Ejakulatdiagnostik empfehlenswert. Hierbei muss allerdings betont werden, dass hinsichtlich der Fertilität ausschließlich das Spurenelement Zink besondere Beachtung verdient, da sich trotz zahlreicher Korrelationen zu konventionellen Ejakulatparametern für die übrigen gemessenen Seminalplasmabestandteile keine signifikanten Korrelationen zu den anamnestisch erhobenen Fruchtbarkeitsdaten ergaben.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2005