Structure and function analysis of Factor VII Activating Protease (FSAP) with respect to vascular pathophysiology

Abstract

The functions of factor VII activating protease (FSAP) in the vascular system have been investigated. Marburg I (MI)-FSAP-polymorphism correlates with various vascular diseases and is characterized by a reduced proteolytic activity. Hence, the activity of FSAP appears to be of pivotal importance in vascular homeostasis. Further evidence for the contribution of FSAP to vascular pathophysiology was provided by the fact that FSAP-antigen and mRNA have been found within atherosclerotic plaques. FSAP circulates as an inactive zymogen in plasma and is activated by negatively charged polyanions. However, the precise mechanisms of FSAP-activation have not yet been elucidated. FSAP is known to inhibit platelet-derived growth factor (PDGF)-BB-mediated cell activation, whilst PDGF-BB is an important factor in the development of atherosclerosis and contributes to other fibrotic and cancer-related diseases.FSAP has been shown to be activated by heparin and RNA. Herein it has been demonstrated that polyphosphate, released by activated platelets, is a newly detected cofactor for FSAP. The high negative charge-to-size ratio and overall molecular size of polyanions qualify them as cofactors for FSAP. Furthermore, by using recombinant & #916;EGF-3-FSAP, the importance of FSAP s EGF-3 domain in its interaction with polyanions could be confirmed. Heparin is released by mast cells, polyphosphate by platelets and RNA might be released from dying cells. Therefore, these cofactors can be present at sites of atherosclerosis and regulate FSAP function in these circumstances.FSAP is inhibited by serine protease inhibitors, such as protease nexin (PN)-1, plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 and antithrombin III. If FSAP was complexed with either PN-1 or PAI-1 its internalization in a LDL receptor-related protein (LRP)-dependent mechanism by smooth muscle cells and fibroblasts could be shown. Hence, LRP accounts for the clearance of FSAP-inhibitor complexes. The functionality of LRP is crucial in the regulation of PDGF-BB signaling. However, the interaction of FSAP-inhibitor complexes with LRP had no impact on the LRP-mediated regulation of PDGF-BB signal-transduction. The inhibitory effect of FSAP on PDGF-BB-dependent cell activation occurs through specific cleavage of the PDGF-BB molecule. The cleavage-sites of FSAP in the PDGF-BB molecule have been identified. This revealed that FSAP-dependent cleavage had destroyed the receptor binding motif of PDGF-BB. Hence, the reduced proteolytic activity of MI-FSAP is the determinant for its correlation with vascular diseases, which has been demonstrated by its inability to inhibit PDGF-BB-dependent smooth muscle cell activation. With the herein presented results, new insights into the complex mechanisms that are involved in FSAP-regulation have been created. The improved description of these mechanisms may lead to novel therapeutic approaches in the treatment of fibro-proliferative, cancer-related and atherosclerotic diseases. Die Aufgaben der Faktor VII aktivierenden Protease (FSAP) im vaskulären System wurden untersucht. Der Marburg I (MI)-FSAP Polymorphismus zeigt eine Verbindung zu verschiedenen vaskulären Erkrankungen auf, und zeichnet sich durch eine verringerte enzymatische Aktivität aus. Daraus wird ersichtlich, dass die Aktivität der FSAP von entscheidender Bedeutung für die vaskuläre Homeostase ist. Weitere Hinweise auf eine Verbindung zur vaskulären Pathophysiologie wurden durch die Tatsache, dass Protein und mRNA der FSAP in arteriosklerotischen Plaques gefunden wurden, geliefert. Die FSAP zirkuliert als inaktives Zymogen im Plasma und wird von negativ geladenen Polyanionen aktiviert. Die genauen Mechanismen zur Aktivierung der FSAP sind jedoch noch nicht aufgeklärt. Es ist bekannt, dass die FSAP die platelet-derived growth factor (PDGF)-BB abhängige Zellaktivierung inhibiert, während PDGF-BB ein wichtiger Faktor für die Entstehung von Arteriosklerose, und beteiligt an fibrotischen und krebs-assoziierten Erkrankungen, ist.Es wurde gezeigt, dass die FSAP von Heparin und RNA aktiviert wird. Hier wird nun demonstriert, dass Polyphosphat, welches von aktivierten Thrombozyten freigesetzt wird, ein neu entdeckter Kofaktor der FSAP ist. Ein hohes Verhältnis von negativer Ladung zur Größe und die allgemeine molekulare Größe qualifizieren Polyanionen zu Kofaktoren der FSAP. Weiterführend konnte, durch die Verwendung von rekombinantem & #916;EGF-3-FSAP, die Bedeutung der FSAP-EGF-3 Domäne, für ihre Interaktion mit Polyanionen, bestätigt werden. Heparin wird von Mastzellen freigesetzt, Polyphosphate von Thrombozyten und RNA könnte von sterbenden Zellen freigesetzt werden. Demnach können diese Kofaktoren in Bereichen von Arteriosklerose vorhanden sein und dort die Funktionen der FSAP regulieren.Die FSAP wird durch Serinprotease Inhibitoren wie Protease Nexin (PN)-1, Plasminogen Aktivator Inhibitor (PAI)-1 und Antithrombin III inhibiert. Wenn die FSAP in Komplexen mit PN-1 oder PAI-1 vorlag, konnte ihre Internalisierung durch einen LRP abhängigen Mechanismus, in glatten Muskelzellen und Fibroblasten, aufzeigen werden. Demzufolge ist LDL Receptor-releated protein (LRP) für die Beseitigung der FSAP-Inhibitor Komplexe verantwortlich. Die Funktionalität des LRP ist wichtig für die Regulation des PDGF-BB Signalweges. Die Interaktion der FSAP-Inhibitor Komplexe mit LRP hatte jedoch keinen Einfluss auf die LRP abhängige Regulation der PDGF-BB Signalübertragung.Der inhibitorische Effekt der FSAP auf die PDGF-BB abhängige Zellaktivierung wird durch eine spezifische Spaltung des PDGF-BB Moleküls erzielt. Die Spaltstellen der FSAP im PDGF-BB Molekül wurden identifiziert. Damit wurde aufgezeigt, dass durch die FSAP abhängige Spaltung das rezeptorbindende Motiv des PDGF-BB zerstört wird. Demzufolge ist die verringerte proteolytische Aktivität der MI-FSAP der bestimmende Faktor für ihre Verbindung zu vaskulären Krankheiten, welches durch ihre Unfähigkeit zur Inhibition der PDGF-BB abhängigen Aktivierung glatter Muskelzellen aufgezeigt wurde.Mit den in dieser Arbeit präsentieren Resultaten wurden neue Einsichten in die komplexen Mechanismen, welche an der Regulation der FSAP beteiligt sind, geschaffen. Ein besseres Verständnis dieser Mechanismen könnte zu neuen therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von fibro-proliferativen, krebs-assoziierten und arteriosklerotischen Krankheiten führen.