Gerichtete Mutagenese am Natrium-abhängigen Gallensäuretransporter Ntcp zur Bedeutung negativ geladener Aminosäuren als Natrium-Sensor
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Zusammenfassung
Gallensäuren zirkulieren bei Säugern im enterohepatischen Kreislauf zwischen dem Darm,der Leber und der Galle. An der Leber der Ratte werden Gallensäuren durch dasNa+/Taurocholat cotransportierende Polypeptid (Ntcp) aus dem Portalblut in dieLeberparenchymzellen transportiert. Ziel dieser Untersuchungen war es, überMutagenesestudien am Ntcp funktionell notwendige, negativ geladene Aminosäuren in demProtein zu identifizieren und zu klären, ob diese an der Na+-Bindung des Proteins beteiligtsind. Durch Site-directed Mutagenese wurden, ausgehend von dem cDNA-Klon des Ntcp,Mutantenklone generiert, bei denen je eine von sieben negativ geladenen Aminosäuren,nämlich D24, E47, E89, D115, D147, E257 und E277 (fünf konservierte und zwei nichtkonservierte), durch ihre neutralen Amide ersetzt wurden. Bei heterologer Expression in X.laevis-Oozyten wurde die Funktionalität der Klone durch Messung der[3H]Taurocholataufnahme in die Zellen geprüft. Die drei Mutationen D24N, D115N undE257Q reduzierten die [3H]Taurocholataufnahme hochsignifikant. Diese Klone wurden nachMarkierung mit dem FLAG®-Tag durch Immunfluoreszenzmikroskopie auf ihre Präsenz inder Oozytenmembran untersucht. Von den drei waren die Mutanten D115N und E257Q in derOozyten-Oberfläche nachweisbar, während D24N dort fehlte. Dies zeigt, dass D24 zurkorrekten Membraninsertion des Proteins notwendig ist. Durch Variation der Na+-Konzentration im Medium wurde die Na+-Abhängigkeit der [3H]Taurocholataufnahme derKlone D24N, D115N und E257Q und des Wildtyp-Ntcp bestimmt. Beim Wildtyp-Ntcp undden Mutanten D24N und D115N ergab diese eine Sättigungskinetik. Bei Mutante E257Qbestand eine lineare Beziehung zwischen [3H]Taurocholataufnahme und der externen Na+-Konzentration. Der Hill-Koeffizient der [3H]Taurocholataufnahme des Wildtyp-Ntcp beträgt2, er verringerte sich auf 1 für die Mutante D115N und 0,4 für die Mutante E257Q. Hierausläßt sich schließen, dass E257 an der Natriumbindung beteiligt ist. Diese Ergebnisse führten zu einer Hypothese über die Struktur-Funktions-Beziehung in demNtcp-Molekül, nach der sich in der Region des E257 eine Struktur ausbildet, die vergleichbareinem P-loop in Kaliumkanälen, in die Pore des Transporters hineinragt und bei der E257 eineNatriumbindungsstelle darstellt.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2003