Die Beeinflussung von Zellen durch kommerziell vertriebene Transfektionsreagenzien und Negativkontroll-siRNAs

Abstract

Die Transfektion synthetischer kleiner interferierender (si)RNA in kultivierte Zellen bildet die Grundlage für Studien, die die RNA-Interferenz (allgemein als „Gen-Knockdown“ bezeichnet) benutzen, um die Auswirkungen des Verlusts der Gen- oder Proteinexpression auf einen biologischen Signalweg oder Prozess zu untersuchen. In diesen Studien sind die Mock-Transfektionen (mit Transfektionsreagenzien allein) und die Verwendung synthetischer, kommerziell vertriebenen Negativkontroll-siRNAs (vermeindlich inert) als wesentliche Negativkontrollen zu betrachten. Negativkontrollen sind für jedes Experiment ein wesentlicher Bestandteil, da sie die Basislinie markieren, mit der die Ergebnisse verglichen werden müssen. Ohne diese Grundlinie sind Daten aus Experimenten nur Punkte in einer Abbildung, ohne Koordinatensystem, und die Daten können nicht richtig interpretiert werden. Diese Arbeit zeigt, dass drei weitverbreitete Transfektionsreagenzien (X-tremeGENE™, HiPerFect und Lipofectamine® 2000) und fünf kommerziell vertriebene Kontroll-siRNAs (von den Biotechnologie-Unternehmen: Ambion, Sigma, Santa Cruz, Cell Signaling Technology und Qiagen) nicht als generell inert in Zellkulturstudien anzusehen sind. Sowohl die Transfektionsreagenzien als auch die Negativkontroll-siRNA störten mRNA- und Protein-Steady-State-Level von Komponenten des kanonischen transformierenden Wachstumsfaktors TGF-β-Signalwegs, der als Modelsystem verwendet wurde, in primären Mäuselungenfibroblasten und in NIH/3T3-Zellen (einer weit verbreiteten embryonalen Mäusefibroblastenzelllinie), wohingegen in MLE-12-Zellen, einer häufig verwendete Epithelzelllinie, die Steady-State-Level nahezu vollständig unbeeinflusst blieben. Darüber hinaus reduzierten Transfektionsreagenzien und Negativkontroll-siRNAs die Lebensfähigkeit und Proliferationsrate sowohl von Lungenfibroblasten als auch von NIH/3T3-Zellen. Diese Daten stellen für Forschende einen Warnhinweis dar, der sie dazu veranlassen sollte, die Auswirkungen der Kontrollinterventionen in RNA-Interferenzstudien, wie der Mock-Kontrolle und der Negativkontroll-siRNA, sorgfältig zu berücksichtigen. Folglich sollten Forschende erwägen, mehr als nur eine kommerziell erhältliche Negativkontroll-siRNA zu verwenden und sich darüber im Klaren sein, dass es wahrscheinlich notwendig ist, individuell synthetisierte Negativkontroll-siRNAs zu verwenden, die an den Zelltyp und das Experiment angepasst wurden.