Attenuierung von Pestiviren durch gezielt ins Genom eingeführte Mutationen : In vitro und in vivo Experimente mit CSFV und BVDV
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Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit beschreibt in vitro und in vivo Studien, mit denen der Einfluß verschiedener Punktmutationen in Pestivirusgenomen auf die Virulenz der Erreger und deren Fähigkeit zur diaplazentaren Infektion von Föten in trächtigen Tieren untersucht werden sollte. Dabei wurden Versuche mit dem Virus der klassischen Schweinepest (CSFV) und dem Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV) durchgeführt. Angriffspunkte für die Mutationen waren die Genombereiche, die für das als RNase fungierende Strukturglykoprotein Erns und die Protease Npro kodieren. Für CSFV wurde das Verhalten der RNase-negativen Mutante W300G untersucht. Diese Mutante ist zwar in der standardmäßig verwendeten permanenten Schweinenieren-(SK6)-Zellinie stabil, revertiert aber in infizierten Tieren umgehend zu wt Virus. Diese Reversion erfolgte so schnell, daß die Mutante in Proben aus infizierten Tieren nie nachweisbar war. Die Reversion scheint offensichtlich Zell-spezifisch zu sein, da auch in zwei Linien von Gewebekulturzellen die Restauration der Wildtypsequenz beobachtet werden konnte. Die RNase-negative CSFV Mutante H346deletion, für die in früheren Versuchen gezeigt wurde, daß sie im infizierten Tier keine nennenswerte Virämie erzeugt, wurde in einem Experiment mit trächtigen Schweinen daraufhin untersucht, ob sie zu einer diaplazentaren Infektion der Föten fähig ist. Dabei zeigte sich, daß die RNase Mutation nicht ausreicht, die Infektion der Föten zu verhindern. Weiterhin wurde versucht, nähere Informationen über das Wirkprinzip der Erns-RNase zu erhalten, indem Schweine mit einem RNase-negativen Virus infiziert und die RNase in trans durch ein Vektor-Virus zur Verfügung gestellt wurde. Ziel dieses Versuches war, zu überprüfen, ob durch Supplementierung der RNase die attenuierendeWirkung der RNase-Mutation im Virus aufgehoben werden kann. Diese Versuche führten nicht zu einer klaren Aussage, weil vermutlich die in trans bereitgestellte Menge an RNase nicht ausreichte oder das Protein seinen Zielort nicht erreichte. Um diese Probleme lösen zu können, wurden Versuche unternommen, die RNase in vitro zu exprimieren und zu reinigen. Drei verschiedene Expressionssysteme wurden getestet, die sich aber aus unterschiedlichen Gründen alle als nicht tauglich erwiesen. Zur Klärung der strittigen Frage, ob die Deletion des Proteins Npro zu einer Attenuierung des CSFV führt, wurde ein Tierexperiment mit einer Npro Deletionsmutante des CSFV durchgeführt. Trotz heterogenen Verlaufs der Erkrankungen bei den einzelnen infizierten Tieren war offensichtlich, daß die verwendete Deletionsmutante anders als ähnliche in der Literatur beschriebene Mutanten nicht apathogen ist. Dieses Ergebnis bestätigte die Daten aus früheren Experimenten in unserem Labor. Die drei BVDV-2 Mutanten XIKE-B (Erns RNase-negativ), XIKE-A-NdN (Npro-deletiert) und XIKE-B-NdN (Erns RNase-negativ und Npro-deletiert) wurden in Experimenten mit trächtigen Tieren auf ihre Fähigkeit zur diaplazentaren Infektion der Föten untersucht. Dabei zeigte sich, daß die beiden Einzelmutanten im Gegensatz zur Doppelmutante eine persistente Infektion in den Föten etablieren können. Parallel dazu wurden Studien durchgeführt, die der Überprüfung der Vakzinierungseffizienz dieser Mutanten dienten. Diese Versuche ergaben Hinweise darauf, daß XIKE-B eine protektive Immunität gegen BVDV-1 und BVDV-2 induzieren kann, während Vakzinierung mit XIKE-B-NdN nur vor den Folgen einer BVDV-2 Infektion schützt.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : http://www.dvg.net/ DVG Service, 2007