Die sichere Identifizierung von Proteinen aus komplexen Probenmischungen stellt ein Problem in der Proteomforschung dar. Ein kürzlich durchgeführter Ringversuch zur Proteinidentifizierung aus einer aliquotierten Zelllysatprobe ergab nur wenige Übereinstimmungen zwischen den Ergebnissen aus den verschiedenen massenspektrometrischen Methoden der sechs teilnehmenden Firmen.[1] Nur 3 % aller identifizierten Proteine konnten von allen Teilnehmern gemeinsam gefunden werden, während 97 % der insgesamt identifizierten Proteine von mindestens einem Teilnehmer nicht gefunden wurden. Dies weist darauf hin, dass validierte, sichere Verfahren in der Massenspektrometrie (MS) noch fehlen. Ein wesentliches Problem scheint in den wahrscheinlichkeitsbasierten Zuordnungen der in Datenbanken verzeichneten Sequenzen zu den MS-Daten zu liegen. Die Wahl der Methode zur Interpretation der Fragmentionen-(MS/MS-) Spektren für die Proteinidentifizierung aus hochkomplexen Peptidmischungen spielt dabei eine Schlüsselrolle hinsichtlich der Qualität dieser Ergebnisse. Es hat sich erwiesen, dass gerade wenn das Spaltenzym nicht bekannt ist, eine Datenbank-unterstützte Proteinidentifizierung meistens fehlschlägt oder fragwürdige, mehrdeutige Ergebnisse liefert.
In dieser Arbeit wurde ausgehend von der klassischen, aufwändigen Analytik MHC-Klasse-I bindender Peptide eine neue Methode entwickelt, die zu validierten, vertrauenswürdigen Ergebnissen führt.[2] Sie besteht aus einer minimierten Probenaufarbeitung einer renalen Humankarzinomzelllinie mittels unspezifischer Säureelution und Ultrafiltration und basiert auf einer verifizierbaren Analyse von hochpräzise gemessenen MS- und MS/MS-Daten. Bei deren Auswertung wird neben der automatischen Datenbanksuche ein Datenbank-unabhängiges, auf Aminosäurezusammensetzungen basierendes de novo-Sequenzierungsverfahren [3] angewendet. Dieses Verfahren dient zur Datenverifizierung der im ersten Schritt erhaltenen Ergebnisse auch ohne Angabe eines spezifischen Spaltenzyms und stützt sich auf die Kenntnis der akkuraten Massen nicht nur der Vorläuferionen, sondern auch der Fragmentionen. Das neu entwickelte Validierungsverfahren nutzt somit ein iteratives Zusammenspiel von schneller Datenbanksuche und zuverlässiger de novo-Sequenzierung auf Grundlage der höchstgenau gemessenen Massen. Durch diese neu entwickelte Methode wurden autoproteolytisch entstandene Peptide mit unbekannter Entstehungsgeschichte sowie ihre zugehörigen Ursprungsproteine eindeutig identifiziert, so dass auch solche Peptide eine nützliche Quelle für die Charakterisierung biologischer Proben darstellen können. Außerdem konnten durch die analoge Anwendung des neuen Validierungsverfahrens auf die mithilfe der spezifischen Immunaffinitätschromatographie klassisch aufbereiteten Proben weitere MHC-Klasse-I bindende Peptide auch ohne zusätzliche Synthese der Referenzpeptide erfolgreich identifiziert werden.
[1] Chamrad und Meyer, Nature Methods 2005, 2, 647
[2] Thieu et al., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 3317
[3] Spengler, Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2004, 15, 703
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