Untersuchungen zur signalabhängigen Regulation der Enzymaktivität von Argonaut 2
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Zusammenfassung
Argonaut 2 (Ago2) ist das katalytische Zentrum des RNA-induced silencing complex (RISC). Dieses Protein besitzt eine Endonukleaseaktivität und spaltet siRNA/mRNA- oder miRNA/mRNA-Hybride. Es kommt zu einer sequenzspezifischen posttranskriptionellen Genstilllegung (silencing), welche wichtig für die Regulation der Genexpression in nahezu allen Lebewesen ist. Dieser Prozess wird als RNA-Interferenz (RNAi) bezeichnet. Die Arbeitsgruppe Kracht identifizierte Ago2 als einen Interaktionspartner der MAP-Kinase JNK. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Zytostatika Cisplatin, Doxorubicin und Vinblastin, welche als gemeinsames Merkmal die Aktivierung von JNK haben, auf die Ago2 Aktivität untersucht. Hierzu wurde zunächst ein in vitro RISC-Assay etabliert. Mit diesem ist es möglich, die Aktivitätsänderungen eines rekombinanten GST-Ago2 in der An- oder Abwesenheit von Zellextrakten zu erfassen. Bisher war hierzu der Einsatz radioaktiv markierter RNAs nötig. Es wurde ein nicht-radioaktiver in vitro RISC-Assay etabliert und die Bedingungen zur Durchführung dieses Assays systematisch ausgetestet. Weiterhin wurde der Einfluss der Zytostatika auf die RISC-Aktivität in intakten Zellen mit Hilfe eines Luziferase-Reportergenassays bestimmt. Hierzu wurden in HEK293IL-1R-Zellen ein für Luziferase codierendes Plasmid und eine Luziferase-siRNA transfiziert. Im Anschluss wurden die Zellen mit Cisplatin, Doxorubicin und Vinblastin stimuliert und die Luziferaseaktivität gemessen. Es zeigte sich eine Aktivierung des RISC durch Cisplatin und Doxorubicin. Vinblastin hatte keinen Einfluss auf die RISC-Aktivität. Eine Überexpression von Ago2 führte zu keiner signifikanten Steigerung des Einflusses von Cisplatin, Doxorubicin und Vinblastin auf die Aktivität des RISC. Im Gegensatz zu den Zytostatika führten die JNK-Aktivatoren MEKK1 und ein TAK1kd-TAB1ad-Fusionsprotein in dem gleichen Assay zu einer Hemmung der RISC-Aktivität. Zusammenfassend konnte somit in dieser Arbeit Befunde erhoben werden, die daraufhin deuten, dass die Aktivität von RNAsen aus dem RISC Komplex durch Stresssignalwege moduliert werden. Diese Beobachtungen könnten für das Verständnis der vielfältigen molekularen Wirkungen von zellschädigenden Zytostatika relevant sein.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Gießen : VVB Laufersweiler