Enzymimmuntest zum Nachweis von Oxytetracyclin in Lebensmitteln

Abstract

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung eines enzymimmunologischen Verfahrens zum Nachweis von Oxytetracyclin in Milch und Fisch.Hierzu wurde erstmals zur Immunogensynthese Oxytetracyclin (OTC) an Glukoseoxidase (GOx) mittels Formaldehyd (FA) gekoppelt. Alle drei Kaninchen reagierten mit der Produktion spezifischer Antikörper auf die Impfung. Mit dem Antiserum eines Kaninchens (Nr. 3) und unter Verwendung des mittels Glutardialdehydmethode gekoppelten Beschichtungsantigens OTC-BSA (GA, einstufig) konnten im indirekten Verfahren eine Nachweisgrenze von 3,8 ng/ml in Pufferlösung erreicht werden. Die Verdünnungsreihe der Standardkurve wurde dabei in 1,25% Magermilchpulver-PBS vorgenommen. Der Test wies eine hohe Spezifität auf und zeigte von den anderen fünf getesteten Tetracyclinen lediglich mit Doxycyclin eine Kreuzreaktivität von 1,9%. Eine Überprüfung der praktischen Anwendbarkeit erfolgte in den Lebensmitteln Milch (pasteurisierte Konsummilch) und Fisch (eingefrorene Lachs- und Kabeljaufilets). Durch einfache Entfettung und Verdünnung konnten die Proben direkt in dem entwickelten EIA eingesetzt werden. Mittels künstlicher Kontaminierung wurden Nachweisgrenzen und Wiederfindungsraten ermittelt. In der Probenmatrix Milch (Dotierungen zwischen 12,5 200 ng/ml) betrug die Nachweisgrenze 14 ng/ml, die Wiederfindungsraten lagen bei 78 - 134%. Fisch stellte sich als die problematischere Matrix heraus. Es konnte eine rechnerische Nachweisgrenze von 88 µg/kg ermittelt werden. Die Wiederfindungen lagen zwischen 102,6% und 247,3%. Bei Untersuchung der Fischproben konnte ein regressiver Verlauf der Wiederfindungen festgestellt werden, wobei Dotierungen im Bereich des MRL zu hohen Wiederfindungen weit über 100% führten.Der hier entwickelte EIA ermöglicht einen schnellen Nachweis von Oxytetracyclin in Milch, weit unter dem MRL von 100 µg/kg, und eignet sich aufgrund seiner einfachen Probenvorbereitung gut zum Einsatz als Routineverfahren. The present study describes the development of an enzyme immunoassay for the detection of oxytetracycline in milk and fish.Herefore, to obtain the immunogen, the successful linking of oxytetracycline to Glucose-oxidase by formaldehyde procedure has been established. This method has not previously been reported. Three rabbits were immunized in order to gain polyclonal antibodies.To establish the indirect EIA, sera of rabbit no. 3 in combination with the coating OTC-BSA (GA, one step), synthesized by glutaraldehyde (GA) method, was able to generate a limit of detection (LOD) of 3.8 ng/ml in buffer solution. Serial dilutions used for standard curves were made in 1,25% skimmed-milk-powder-PBS.To determine the specifity of the antibodies cross reaction has been tested to five other tetracycline antibiotics. Only doxycycline showed a cross reaction of 1,9%.First practical applicability of the test was verified with certain foodstuff like pasteurized milk and fish (frozen filets of salmon and cod). Samples could be directly analysed only after passing a defatting and dilution step. To determine the LOD´s and the recovery rates, samples had to be artificially contaminated. In milk the achieved LOD was 14 ng/ml, the recovery rate was about 78 - 134% in the spiked levels of 12,5 - 200 ng/ml oxytetracycline. Concerning the sample fish it showed to be the more defiantly matrix. The LOD was 88 µg/kg in fish. Recoveries of oxytetracycline in spiked fish were 103 - 207%. The recovery rate in fish samples showed a regressive behavior taking into account that samples spiked at levels of the MRL led to recoveries exceeding 100%.This EIA can be applied as quick detection method for oxytetracycline in milk, far below the MRL of 100 µg/kg and because of the simple sample pre-treatment it would be a suitable routine method.