Charakterisierung der Expression und Aktivität von Ras-Isoformen in humanen Lungenkarzinomzellen mit onkogenem K-Ras 4B und Modulation der Zellmotilität
Ras-Proteine gehören zur Familie der kleinen GTP-bindenden Proteine, die als molekulare Schalter in der Zelle eine zentrale Rolle einnehmen. Eine aktivierende Mutation von K-Ras findet sich in etwa 30 % der humanen Adenokarzinome der Lunge. In dieser Arbeit wurde die Expression, Aktivität und Wachstumsfaktor-vermittelte Aktivierbarkeit von K-Ras im Vergleich zu den beiden Ras-Isoformen H-Ras und N-Ras in Lungenkarzinomzellen untersucht und der Einfluss von K-Ras auf das Migrationsverhalten analysiert. Hierfür wurden humane Lungenade- nokarzinomzelllinien mit aktiverender K-Ras-Mutation (A427, A549, H358, HCC44) und ohne Mutation (Colo699) untersucht. Als Vergleich diente die Pankreaskarzinomzelllinie Panc1 mit aktivierender K-Ras Mutation. Das Vorliegen aller Ras-Isoformen konnte im Immunblot in jeder untersuchten Zelllinien bestätigt werden. Als am stärksten exprimierte Isoform konnte K-Ras identifiziert werden, gefolgt von N-Ras und H-Ras. In Ras-GTP-Bindungsassays wurde gezeigt, dass K-Ras auch den größten Anteil des aktiven Ras in allen untersuchten Zelllinien repräsen- tiert. Durch Stimulation mit epidermal growth factor (EGF) konnten alle Ras-Isoformen aktiviert werden, am stärksten nahm die Aktivität von N-Ras zu. K-Ras ließ sich in Zellen mit Wildtyp K-Ras (Colo699) oder heterozygoter K-Ras-Mutation (A427, H358, HCC44) stimulieren, in Zellen mit homozygoter K-Ras-Mutation (A549) konnte keine weitere Aktivierung erzielt werden. Zur Charakterisierung des Migrationsverhaltens der Zellen wurden Wounding Assays, bei denen die Dauer bis zum Verschluss einer in einen konfluenten Zellrasen gesetzten Wunde gemessen wird, durchgeführt. Hier zeigte sich eine große Heterogenität zwischen den Zellinien bei der benötigten Zeit bis zum Wundverschluss. Durch EGF-Stimulation konnte ein beschleunigter Verschluss des Wundspalts beobachtet werden, wobei die Zunahme der Verschlussgeschwin- digkeit mit einer Steigerung zwischen 7,9 % - 97,9 % im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle sehr unterschiedlich ausfiel. Eine Ras-Blockade mit Farnesyltransferase-Inhibitor FTI-227, den K-Ras-Inhibitoren Fendiline bzw. FTS führte zur Verlangsamung der Zellmigration. Durch Be- handlung der Zellen mit Ras-Inhibitor und Stimulation mit EGF konnte der inhibitorische Effekt von FTI-227 und Fendiline revertiert werden. Bei FTS, welches auch die stärkste Verlangsamung der Migration hervorrief, konnte der inhibitorische Effekt durch Stimulation mit EGF nicht kompensiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte die Verteilung und unterschiedliche Aktivierbarkeit der Ras-Isoformen durch EGF sowie die Relevanz von K-Ras für die Migration in Lungenadenokarzinomzellinien gezeigt werden.
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