Aufnahme und Funktion von konventionellen, targetisierten und PEGylierten Glucose-Oxidase-Liposomen in NADPH-Oxidase-defiziente Granulozyten: Untersuchungen an Blutzellen und der gp91phox-/-B6 129S6 Cybb tm1din-Maus
Bei der septischen Granulomatose (chronic granulomatous disease, CGD) handelt es sich um einen NADPH-Oxidase-Defekt in Phagozyten. Ziel dieser Arbeit war es, durch das Einbringen von Glucoseoxidase-Liposomen (GOL) unter Bildung von Wasserstoffperoxid mit Hilfe von Glucose den oxidativen Burst zu rekonstituieren.
Die Aufnahme von verschiedenen markierten Liposomenpräparationen in Phagozyten wurde mittels FACS-Messung überprüft. Am besten geeignet war die Markierung mit 0,5 Mol% Rhodamin-PE. Die 200nm großen, negativ geladenen EPC:EPG:Chol-Liposomen wurden am besten aufgenommen.Die Rekonstitution des oxidativen Bursts in vitro wurde mit Hilfe des DHR-Assays und der Chemilumineszenz-Messung in NADPH- Oxidase defizientem Maus- und Menschenblut bei Inkubation mit GO-Liposomen nachgewiesen.
DCGD-Mäuse (gp 91-/-) wurden mit EPC:EPG:Chol:GOL behandelt. Es kam weder zu einer Hochregulierung von Komplementrezeptoren, noch zu Auswirkungen auf den Blutglucosegehalt, das Verhalten oder das Gewicht der Tiere. Nach 24h war GO in Leber und Milz, jedoch in keinem anderen untersuchten Organ nachweisbar. Es wurden große funktionelle Enzymmengen nachgewiesen, jedoch keine Rekonstitution des oxidativen Bursts (DHR-Assay). Bei Infektionsversuchen mit Staph. aureus und Burk. cepacia bestand kein Unterschied im Krankheitsverlauf zwischen behandelter und unbehandelter Gruppe.
Die Auswirkung der liposomalen Verkapselung auf die Antikörperbildung wurde mit Hilfe eines neu etablierten ELISAs untersucht. Sie führt zu höheren Antikörpertitern als die Verwendung gelöster GO. Bei der Verwendung von Liposomen als Arzneimittelcarrier ist also die Verwendung eines autologen und somit nicht immunogenen Enzyms anzustreben.Um die Aufnahme von besser sterilfiltrierbaren, kleinen Liposomen in Phagozyten zu ermöglichen, wurde die Oberfläche durch PEGylierte Sojasterole funktionalisiert. Mit der Koppelung von IgG wurde die Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose angestrebt.
Albumin diente als Vergleichsprotein. Die proteingekoppelten Liposomen wurden in Vollblut wesentlich besser aufgenommen als die bisher verwendeten Liposomen. Zwischen IgG und Albumin gab es keine nennenswerten Unterschiede im Aufnahmeverhalten. Ohne Serum fand keine Aufnahme statt. Vermutlich spielt die Opsonisierung der Liposomen durch C3b oder IgG bei der Aufnahme eine große Rolle.
Mit den Vorstufen für gekoppelte Liposomen EPC:EPG:Chol:PEG-Liposomen wurdenpharmakokinetische Untersuchungen durchgeführt. Ihre Elimination erfolgte um ein vielfaches langsamer als die der bisher eingesetzten Liposomen, wobei der Organgehalt gering blieb. Bei einigen Versuchstieren war der oxidative Burst teilweise rekonstituiert.
Im Blutbild der Maus fiel die niedrige Granulozytenzahl (unter 10% der Leukozyten) auf. Dabei decken sich die ermittelten lymphozytären Differentialblutbilder der CGD-Mäuse mit den Literaturdaten für den Wildstamm. Für Granulozyten der verwendeten CGD-Mäuse und des Wildtyps C57Bl6 wurde zudem mit Hilfe von ADVIA-Messungen ein sehr niedriger Myeloperoxidasegehalt nachgewiesen. Es ist also von einer stark reduzierten Bildung der bakteriziden hypochlorigen Säure auszugehen. Das Mausmodell als einziges vorhandenes Knock-out Modell erwies sich deshalb für die Fragestellung dieser Doktorarbeit als nur bedingt geeignet.
Wir schlagen die ex vivo Inkubation von autologem Vollblut mit IgG- oder HSA- targetisierten Superoxidbildenden Liposomen mit guter Granulozytenspezifität vor.
Als nicht immunogenes Enzym kommt die Xanthinoxidase in Frage. Diese Therapie könnte ihren Platz in der Intensivmedizin und in der Vorbereitungsphase belastender kurativer Therapien finden.
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