In der vorliegenden Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob die atoxischen gentechnisch hergestellten Alphatoxinvarianten (rAT) 121A/91und 121A/91-His212 die zur Immunisierung gegen das C. perfringens Alphatoxin Verwendung finden können. Das rAT121A/91 ist dasrekombinante Analog der atoxischen Alphatoxinvariante 121A/91, die vom natürlich vorkommenden C. perfringens Feldisolat 121A/91sezerniert wird. Die Variante 121A/91-His212 ist durch in vitro Mutagenese aus dem AT121A/91 hervorgegangen. Hierbei wurde dasArginin an Position 212, entsprechend der Wildtyptoxin-Sequenz, durch ein Histidin ersetzt. Studien mit den beiden rekombinantenVarianten und dem Alphatoxinspezifischen monoklonalen Antikörper 3B4 zeigten, daß die Alphatoxinvariante 121A/91- His212 einehöhere Bindungsaktivität gegenüber dem monoklonalen Antikörper aufweist als das rAT121A/91. Dies läßt darauf schließen, daß sich dasHis212 in einem für die Bindung essentiellen Aminosäurebereich befindet.
Die beiden Alphatoxinvarianten ließen sich effektiv in E. coli pASK-IBA2-Expressionsvektoren exprimieren undaffinitätschromatographisch aus dem Periplasmaextrakt aufreinigen. Die Alphatoxinvarianten waren bei Immunisierungsversuchen in derMaus gut verträglich. Bei der Verwendung der Impfkandidaten in MF59, einem Öl in Wasser Adjuvans, traten bei der s.c. Immunisierungkeine und bei der i.p. Applikation nur geringgradige Allgemeinstörungen auf. Die s.c. Vakzinierung mit dem durch in vitro Mutagenesegewonnenen rAT121/91-His212 in Alu-Gel führte hingegen zu entzündlichen Veränderungen an der Applikationsstelle.
Im ELISA konnte gezeigt werden, daß die i.p. Immunisierung mit beiden Varianten in MF59 zu Alphatoxin-spezifischen Antikörper Titernvon 1: 1.024.000 führte. Obwohl sich die Titer nicht in ihrer Höhe unterschieden, konnte im in vitro Hämolyse-Neutralisationsassaynachgwiesen werden, daß die mit dem rAT121A/91-His212 induzierten Antiseren eine stärkere antihämolytische Wirkung aufwiesen. Da die intraperitoneale Applikation auf die Anwendung im Mausmodell begrenzt ist, wurde das rAT121A/91-His212 zudem bei subcutanerImmunisierung getestet. In Kombination mit MF59 führte dies zu vierfach geringeren Antikörperkonzentrationen als nach intraperitonealerImmunisierung. Trotz niedrigerer Alphatoxin-erkennender Antikörpertiter war der Anteil antihämolysierender Antikörper jedoch um denFaktor zwei höher, als nach entsprechender i.p. Immunisierung.
Die enzymatische Aktivität des Alphatoxins konnte mit beiden Seren in Kombination mit MF59 unabhängig vom Applikationswegneutralisiert werden. Die Seren, die mit Alu-Gel als Adjuvans bzw. ohne die Zugabe eines Adjuvans gewonnen worden waren, besaßenkeine PLC-inhibierende Wirkung.
Im Toxinchallenge-Versuch war das rAT121A/91-His212 dem rAT121A/91 eindeutig überlegen. Bei der Verwendung vonrAT121A/91-His212 in Kombination mit MF59 überlebten bei i.p. Immunisierung bis zu 76% und bei s.c. Applikation bis zu 42% der Tieredie Belastung mit dem Wildtyptoxin. Bei den Tieren der Adjuvanskontrollen betrug die maximale Überlebensrate 17%. Die i.p.Immunisierung mit rAT121A/91 in MF59 führte hingegen nicht zu einer nachweisbaren Schutz der Tiere.
Die im in vivo Belastungsversuch gewonnenen Ergebnisse wurden in einem in vitro Neutralisationsversuch bestätigt. Hierbei wurde mitAntiserum präinkubiertes Alphatoxin Mäusen intraperitoneal appliziert. Nur Tiere, denen ein Gemisch aus Alphatoxin mit durch i.p.Immunisierung von rAT121A/91-His212 in MF59 gewonnem Serum injiziert wurde, überlebten.
Nach Vakzinierung von Mäusen mit dem durch in vitro Mutagenese gewonnenen rAT121A/91-His212 gelang es, Antiseren zu gewinnen,die sowohl die enzymatische Aktivität, als auch die hämolytische Wirkung des Alphatoxins neutralisierten. Die intraperitonealeVakzinierung mit der Alphatoxinvariante und einem Öl in Wasser Adjuvans war zudem geeignet, die letale Wirkung des Wildtyptoxinssowohl im in vitro Neutralisationsassay als auch im in vivo Belastungsversuch vollständig zu inhibieren bzw. signifikant zu reduzieren. DasrAT121A/91-His212 ist somit ein Impfantigen, das sich für eine aktive Immunisierung gegen das Alphatoxin von C. perfringens eignet.
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