In Cyanobakterien wird das Signaltransduktionsprotein PII in Abhängigkeit der Kohlenstoff- und Stickstoffversorgung der Zellen durch eineKinase phosphoryliert und durch eine Mg2+-abhängige Phosphatase dephosphoryliert. Zunächst wurde die beteiligte Phosphatase ineinem teilgereinigten Extrakt aus Synechococcus PCC 7942 biochemisch charakterisiert. Dabei zeigte sich bereits eine synergistischeHemmwirkung durch ATP und 2-Oxoglutarat. Das Inhibitionsmuster und die Mg2+-Abhängigkeit ließen eine Phosphatase eukaryontischenTyps, eine PP2C-Phosphatase vermuten.
Die angestrebte Darstellung der PII-P Phosphatase aus Synechococcus PCC 7942 Zellen gelang aufgrund zu geringer Ausgangsmengennicht.
Mittels reverser Genetik gelang es jedoch im komplett sequenzierten Genom von Synechocystis PCC 6803, eines nahen Verwandten vonSynechococcus PCC 7942 das Gen der PII-P Phosphatase zu identifizieren. Die Inaktivierung des offenen Leserahmens sll1771 (pphA)führte zu der PII-P Phosphatase defizienten Mutante MPphA. MPphA besitzt ein hochphosphoryliertes PII-Protein und ist in derDephosphorylierung von PII-P gehemmt. PphA ist somit die einzige spezifische PII-P Phosphatase.
Phänotypisch weist MPphA bei Wachstum mit Nitrat einen leicht reduzierten Gehalt an Phycobiliproteinen auf, scheidet hohe Mengen anNitrit aus und unterscheidet sich aber ansonsten nicht vom Wildtyp. Untersuchungen zur Nitrataufnahme wiesen darauf hin, daßphosphoryliertes und ligandiertes PII-Protein für die Nitrataufnahme notwendig ist. Unter CO2-limitierenden Bedingungen unterliegt MPphAeiner Kohlenstoffchlorose. Die mögliche Ursache könnte die Inaktivierung oder die fehlende Aktivierung eines hochaffinenCi-Transportsystems, evt. cmpABCD durch das phosphoryliert-vorliegende PII-Protein sein.
Die biochemische Analyse von PphA zeigte, daß PphA als Substrate außer PII-P auch an Serin/Threoninresten phosphoryliertes P-Casein,P-Histon, sowie synthetische Oligopeptide und p-NPP annimmt. Auch ein an einem Tyrosinrest phosphoryliertes Oligopeptid wirddephosphoryliert.
Die Aktivität von PphA wird in Anwesenheit von ATP durch 2-Oxoglutarat vollständig und durch Oxalacetat, Succinat und weitereMetaboliten des C- und N- Stoffwechsels intermediär gehemmt. ATP, ADP und GTP alleine hemmen bereits partiell. Diese Hemmeffektwerden über die Ligandierung des PII-Proteins mit diesen Metaboliten vermittelt und stellen eine metabolische Regulation der PIIPhosphorylierung dar. Die Stammbaumanalyse zeigte, daß PphA zur Gruppe I bakterieller PP2C-Phosphatasen gehört. PphA stellt indieser Gruppe die erste Phosphatase dar, deren Funktion und Substrat in vivo identifiziert sind.
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