Vergleich verschiedener Färbemethoden von aufgetautem Tiefgefrier-Rüdensperma

Abstract

Die vorliegende Studie vergleicht sechs etablierte Färbemethoden (Eosin, Eosin-Nigrosin, Diff-Quick®, Hemacolor®, Spermac®, Formolzitrat-Bengalrosa) für die lichtmikroskopische Untersuchung kryokonservierter Rüdenspermien. Nach dem Auftauen wurden die Proben von zehn Rüden in vier Fraktionen aufgeteilt und entweder keinem oder einem zweistündigen Stresstest bei 6 °C, 18 °C oder 37 °C unterzogen. Ziel war es, die pathomorphologische Varianz für eine bessere Aussagekraft der Untersuchungsergebnisse zu erhöhen. Im Anschluss wurden gefärbte Samenzellpräparate angefertigt und sowohl eine pathomorphologische Begutachtung als auch eine Beurteilung der Färbequalität unmittelbar nach der Präparation durchgeführt. Wiederholungsuntersuchungen zur Lagerungsstabilität erfolgten nach 24 Stunden, 7 Tagen und 3 Monaten. Ergänzend wurde das CASA-System AndroVision® eingesetzt. Pro Färbemethode wurden 40 (Eosin, Diff-Quick®, Hemacolor®) bzw. 80 Präparate (Eosin-Nigrosin, Spermac®, Formolzitrat-Bengalrosa) erstellt. Die Gesamtanalyse umfasste 360 Präparate mit 960 Evaluationsprozessen. Dabei ergaben sich folgende wesentliche Erkenntnisse:

Eosin - Färbequalität: gute Farbintensität, Detailerkennbarkeit und Kontrast, stabil über 3 Monate. - Im Vergleich: Detailerkennbarkeit: zu t0 signifikant schlechter als Spermac® und Formolzitrat-Bengalrosa (jeweils p = 0,029). - Zeitaufwand: schnellste Methode mit mittlerem Arbeitsaufwand zur Präparation und Beurteilung je Objektträger von 8,15 ± 0,36 Min. (mit Vitalitätsbeurteilung +5,29 ± 0,22 Min.). - Kosten: günstigste Methode mit 0,13 € je Präparat für Verbrauchsstoffe; 1,85 € inklusive Personalkosten (mit Vitalitätsbeurteilung +1,12 €). - Stresstest: signifikant mehr rudimentäre Schwänze bei 37 °C im Vergleich zu ungestressten Proben. - Lagerungsstabilität: keine relevanten Veränderungen der Pathomorphologie. - Besonderheiten: sehr gut für die Routinediagnostik geeignet, sofern keine Beurteilung des Akrosoms benötigt wird.

Eosin-Nigrosin - Färbequalität: gute Farbintensität; leicht unterdurchschnittliche Detailerkennbarkeit und Kontrast. - Im Vergleich: signifikant schlechtere Detailerkennbarkeit als Spermac®- und Formolzitrat-Bengalrosa-Färbung; schlechterer Kontrast als Diff-Quick®, Spermac® und Formolzitrat-Bengalrosa (jeweils p = 0,029). - Zeitaufwand: 10,54 ± 0,50 Min. (mit Vitalitätsbeurteilung +5,45 ± 0,28 Min.). - Kosten: 0,26 € Verbrauchsstoffe; 2,49 € inklusive Personalkosten (mit Vitalitätsbeurteilung +1,15 €). - Stresstest: signifikant mehr Pathomorphologien bei 37 °C im Vergleich zu ungestressten Samenzellen (p = 0,012). - Lagerung: keine maßgeblichen Veränderungen der Pathomorphologie oder Qualitätsparameter. - Besonderheiten: feine Strukturen (Schwanzenden) teils nur mit erhöhtem Zeitaufwand beurteilbar, daher eingeschränkt für fein graduierte morphologische Beurteilung geeignet.

Diff-Quick® - Färbequalität: gute Detailerkennbarkeit, mittlere Farbintensität und sehr guter Kontrast. - Im Vergleich: signifikant höherer Kontrast als bei Eosin-Nigrosin (p = 0,029). - Pathomorphologie: niedrigster Anteil pathomorphologischer Veränderungen (Md = 13,75 %); signifikant weniger Schleifenformen als bei Spermac® (p = 0,029). - Zeitaufwand: 10,24 ± 0,38 Min. - Kosten: 0,46–0,91 € Verbrauchsstoffe, abhängig vom Verbrauch der Farblösungen; 2,63–3,08 € inklusive Personalkosten. - Stresstest und Lagerung: keine signifikanten Effekte auf Pathomorphologie-Prävalenzen oder Färbequalität. - Besonderheiten: robuste und schnelle Methode, die sich bei niedrigem Farbstoffverbrauch für Labore mit hohem Probenaufkommen eignet.

Hemacolor® - Färbequalität: gute Farbintensität, Detailerkennbarkeit und Kontrast; vereinzelt hohe Variabilität der Farbintensität (blass) ohne Beeinträchtigung der Beurteilbarkeit. - Zeitaufwand: 10,46 ± 0,32 Min. - Kosten: 0,69–2,28 € Verbrauchsstoffe, abhängig vom Verbrauch der Farblösungen; 2,90–4,49 € inklusive Personalkosten. - Stresstest und Lagerung: keine signifikanten Effekte auf Pathomorphologie-Prävalenzen oder Färbequalität. - Besonderheiten: beständige und schnelle Ergebnisse; wirtschaftlich jedoch nur bei niedrigem Verbrauch der Farblösungen oder geringer Priorität der Wirtschaftlichkeit sinnvoll.

Spermac® - Färbequalität: beste Ergebnisse aller Methoden zu t0. - Im Vergleich: signifikant bessere Detailerkennbarkeit im Vergleich zu Eosin und Eosin-Nigrosin; signifikant höherer Kontrast als Eosin-Nigrosin (jeweils p = 0,029). - Pathomorphologie: höchste Prävalenz schleifenförmiger Spermien (Md = 8,75 %); signifikant mehr als bei Diff-Quick® (p = 0,029). - Zeitaufwand: sehr zeitintensiv mit 29,91 ± 0,33 Min. - Kosten: 1,04 € Verbrauchsstoffe; 7,37 € inklusive Personalkosten. - Stresstest: für rudimentäre Schwänze signifikanter Unterschied zwischen 37 °C (Md = 1,75 %) und 18 °C (Md = 3,5 %, p = 0,047). - Lagerung: signifikante Qualitätsverluste aller Parameter (Farbintensität: t0 im Vergleich zu t1/t3; Detailerkennbarkeit und Kontrast: t0 im Vergleich zu den drei Wiederholungsuntersuchungen); vereinzelt Pigmentverlust. - Besonderheiten: insgesamt geringste Häufigkeit an Artefakten; sehr gut zur unmittelbaren pathomorphologischen Beurteilung inklusive Akrosom geeignet; aufgrund des Zeit- und Kostenaufwands für die Routinediagnostik nur eingeschränkt empfehlenswert.

Formolzitrat-Bengalrosa - Färbequalität: durchweg hohe Mediane in allen Parametern. - Im Vergleich: bessere Detailerkennbarkeit im Vergleich zu Eosin und Eosin-Nigrosin; höherer Kontrast als Eosin-Nigrosin (jeweils p = 0,029). - Pathomorphologie: höchste Prävalenz pathomorphologischer Veränderungen (Md = 22,25 %); gehäuft lanzenförmige Spermienköpfe bei direkter Auswertung (Md = 2,25 %) als Artefakt unzureichend abgeflachter Spermienköpfe, die nach Lagerung nicht mehr auftraten. - Zeitaufwand: durch 30-minütige Lagerungsphase mit 36,00 ± 0,33 Min. zeitaufwändigste Methode. - Kosten: 0,24 € Verbrauchsstoffe; 7,85 € inklusive Personalkosten. - Stresstest und Lagerung: keine signifikanten Effekte auf Pathomorphologie oder Färbequalität; nach dreimonatiger Lagerung höchste Qualitätsparameter. - Besonderheiten: aufgrund sehr guter Färbequalität und Lagerstabilität für präzise pathomorphologische Analysen geeignet; bei effizienter Integration in Laborabläufe zeitsparender als und kostentechnisch vergleichbar mit Eosin, jedoch mit höherer Färbequalität.

Alle Präparate waren zu allen vier Auswertungszeitpunkten auswertbar, sodass sich die sechs Färbemethoden zur Archivierung kryokonservierter Rüdenspermien eignen. Die computergestützte Spermienanalyse (AndroVision®) konnte nicht erfolgreich eingesetzt werden. Infolge der Kryokonservierung wurden vermehrt Schleifenformen, jedoch seltener gebrochene/geknickte Schwänze oder abgelöste Köpfe identifiziert, was möglicherweise methodisch begründet ist. Die Stresstests beeinflussten die Färbequalität nicht, jedoch induzierte der Stresstest bei 37 °C signifikant höhere mediane Anteile pathologischer Auffälligkeiten im Vergleich zu ungestressten Samenzellen (Gesamtanteil pathologischer Spermien: p = 0,012; rudimentäre Schwänze: p = 0,035).