Persistence of H4N6, H5N1, and H6N8 avian influenza viruses, H1N1 human influenza virus, and two model viruses (NDV and ECBO) in various types of water, lake sediment, duck feces, and meat
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Zusammenfassung
Die vorliegende Untersuchung wurde durchgeführt, um die Persistenz von AIV in einer Vielfalt von kontaminierten Medien und Substraten unter unterschiedlichen Umweltbedingungen zu untersuchen. Wildwasservögel dienen als Reservoir für Influenza-A-Viren. Infizierte Vögel scheiden eine hohe Anzahl an Viren über die nasale Sekretion und den Kot aus. Dies führt zu einer erheblichen Kontamination der Umwelt. Um die Tenazität dieser Viren unter natürlichen Bedingungen zu bestimmen, wurde die Persistenz von drei LPAI-Viren (H4N6, H5N1, H6N8), eines humanen Influenza-Viruses (H1N1) und von zwei Modellviren (NDV und ECBO) in unterschiedlichen Wasserarten (destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung und Oberflächenwasser), in Seesediment, Entenkot und Entenfleisch bei 10 °C, 0 °C, 10 °C, 20 °C und 30 °C über eine lange Zeitdauer bestimmt.Das NDV und die Influenzaviren wurden im Allantoissack von 9-11 Tage alten SPF-Hühnerembryonen vermehrt, während das ECBO-Virus in MDBK-Zellkulturen vermehrt wurde. Für die Tenazitätsuntersuchungen in Wasser wurden das destillierte Wasser und die physiologische Kochsalzlösung autoklaviert, während das Oberflächenwasser, das aus dem Bodensee entnommen wurde, ohne Behandlung verwendet wurde. Die Virusquantifizierung wurde zu Beginn der Versuche und dann anschließend in regelmäßigen Zeitabständen mit der Endpunktverdünnungsmethode auf MDCK-Zellen für Influenzaviren, auf Vero-Zellen für NDV und auf MDBK-Zellen für ECBO-Virus durchgeführt. Die Virustiter wurden als TCID50/ml mit der Spearman-Kärber-Formel errechnet. Aus allen Behandlungsgruppen wurden jedes Mal Doppelproben über die Dauer von maximal 36 Wochen untersucht. Die Daten, die der Reihe nach erhalten wurden, wurden mit einem linearen Regressionsmodell analysiert, um die D-90-Werte (benötigte Zeit für die Reduktion der Viruskonzentration um eine Log10-Stufe) zu berechnen und damit die geschätzte Persistenz der Virusinfektiosität bei einer Virusstartkonzentration von 106,00 TCID50/ml.Die Infektiosität der Influenzaviren blieb am längsten in destilliertem Wasser erhalten, gefolgt von physiologischer Kochsalzlösung und Oberflächenwasser. Die einzelnen Influenzaviren waren bei allen Versuchsbedingungen in ihrer Sensitivität gegenüber der Inaktivierung nicht einheitlich. Die D-90-Werte der Influenzaviren in beimpftem destilliertem Wasser bewegten sich zwischen 5-13 Tagen bei 30 °C, 14-37 Tagen bei 20 °C, 62-197 Tagen bei 10 °C und 205-558 Tagen bei 0 °C und 202-642 Tagen bei 10 °C. Die virale Persistenz war kürzer in Oberflächenwasser im Vergleich zu destilliertem Wasser und dieser Trend war bei unterschiedlichen Temperaturen variabel: bei 30 °C und 20 °C war die Persistenz 3-5 mal kürzer, während sie bei niedrigeren Temperaturen in Oberflächenwasser 8-12 mal kürzer war als in destilliertem Wasser. Die mikrobiologischen Analysen zeigten eine Zunahme im Bakteriengehalt bei den mit Virus beimpften Oberflächenwasserproben bei der Lagerung bei 30 °C, 20 °C und 10 °C. Um die Stabilität von viraler RNA in Oberflächenwasserproben zu untersuchen, wurden mit H4N6-Virus, H5N1-Virus und H6N8-Virus beimpfte Oberflächenwasserproben mit der qRRT-PCR zu Beginn der Versuche und nach der Lagerung bei den verschiedenen Temperaturen untersucht. Eine signifikante Menge an viraler RNA war in den kontaminierten Wasserproben bei allen Temperaturen noch feststellbar, nachdem das Virus bei der Titration in Zellkultur nicht mehr nachweisbar war. Die Rate des viralen RNA-Abbaus war größer bei hohen als bei niedrigeren Temperaturen.Eine Keimträgertechnik wurde angepasst, um die Persistenz von Influenzaviren in verschiedenen Substraten zu untersuchen. Elektropositiv geladene Zeta Plus Virosorb-Filterscheiben, die in einer Polycarbonat-Membran mit einer Porengröße von 10 nm eingepackt waren, wurden als Sandwich-Keimträger verwendet. Um die Adsorption von Influenzaviren an die Filterscheiben zu ermöglichen, wurde Phosphatbeladungspuffer mit 3 unterschiedlichen pH-Werten (6,00; 6,50 und 7,40) getestet. Keimträger mit hohen Virustitern wurden mit Phosphatbeladungspuffer bei einem pH-Wert von 7,40 erzeugt. Außerdem wurde ein enormer Verlust bei der Viruskonzentration beobachtet, wenn Filterscheiben, die mit H5N1 beimpft waren, über 6 h trocken aufbewahrt wurden, während der Verlust der Viruskonzentration nur geringfügig war, wenn die beladenen Filterscheiben unter feuchten Bedingungen gelagert wurden. Sandwich-Keimträger wurden zuerst verwendet, um die Persistenz der Influenzaviren und der Modellviren in Oberflächenwasser abzuschätzen. Die Persistenz von allen Viren war bei 10 °C am höchsten, gefolgt von 0 °C, 10 °C, 20 °C und 30 °C. Bei 10 °C resultierte ein einziger Gefrier-Auftau-Zyklus unabhängig von der Lagerdauer in einer abrupten Abnahme im Virustiter, gefolgt von einer Langzeitpersistenz. Interessanterweise persistierten AIV länger in Oberflächenwasser, wenn sie an Keimträgern absorbiert waren, als wenn sie frei in Wasser suspendiert waren. Die D-90-Werte der an Filter adsorbierten AIV nahmen um das drei- bis vierfache bei 10 °C, um das zweifache bei 0 °C, 20 °C und 30 °C und nur geringfügig bei 10 °C im Vergleich zu frei suspendierten Viren zu. In Wasserproben, in denen die Keimträger gelagert wurden, wurde kein Virus nachgewiesen, während die Influenzaviren und Modellviren von den Filterscheiben, die bei niedrigen Temperaturen gelagert wurden, während des ganzen Untersuchungszeitraums erfolgreich eluiert und quantifiziert werden konnten. Dies erlaubt den Einsatz der Technik bei Tenazitätsuntersuchungen in großtechnischem Maßstab.Das Überleben der Influenzaviren und der Modellviren wurde ebenso in Seesediment, Entenkot und Fleisch unter der Verwendung der Sandwich-Keimträgertechnik zahlenmäßig bestimmt. Unter all diesen Substraten war die virale Persistenz in Seesediment am höchsten, verglichen mit Entenkot und Fleisch, in denen die Viruspersistenz ähnlich war. In Seesediment war die Persistenz von AIV sogar höher als in Oberflächenwasser, was anzeigt, dass Sediment die Viren vor den Inaktivierungsfaktoren, die in der Umwelt vorhanden sind, schützen und somit das Überleben der Viren verlängern kann. In Entenkot schwankten die D-90-Werte der Influenzaviren von 1-2 Tage bei 30 °C, 4-7 Tage bei 20 °C, 14-21 Tage bei 10 °C, 47-75 Tage bei 0 °C und 53-71 Tage bei 10 °C. In Entenfleisch wurden sehr ähnliche D-90-Werte ermittelt. Zwei Modellviren (NDV und ECBO-Virus) wurden in die Studie aufgenommen, stellvertretend für behüllte und unbehüllte Modellviren und für den direkten Vergleich mit Influenzaviren, da sie als Testorganismen für virale Tenazitätsuntersuchungen dienen. Im Allgemeinen war die Persistenz von NDV und ECBO-Viren in allen Wasserarten und in all den Substraten durchweg höher als die der Influenzaviren. Von den Modellviren hatte jedoch ECBO-Virus als ein unbehülltes Virus die höheren D-90-Werte, während das behüllte NDV die niedrigeren D-90-Werte hatte, die bei allen Temperaturen denen der Influenzaviren ähnlich waren. Dies zeigt, dass NDV ein Surrogat-Virus für Persistenz- und Inaktivierungsuntersuchungen an AIV sein kann, indem es eine leicht höhere Tenazität als diese Viren hat, was einen ausreichenden Sicherheitsspielraum bei der Interpretation von Ergebnissen gewährleistet.Die Ergebnisse der vorliegenden Studie unterstreichen die Wichtigkeit der Wasserbiotope beim Fortbestand und bei der Verbreitung von AIV in der Umwelt. Bei niedrigen Temperaturen können AIV in Oberflächenwasser, Seesediment, Entenkot und Fleisch über einen längeren Zeitraum infektiös bleiben, was die Persistenz der Viren in der Umwelt über den Winter ermöglicht.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler