Identifizierung der für die Bindung an den zellulären, bovinen Rezeptor CD46 verantwortlichen Sequenzbereiche innerhalb des Glykoproteins E2 von BVDV (NADL)
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Zusammenfassung
In vorausgegangenen Studien konnte mit Hilfe von NADL/ Alfort E2-Chimären die für die CD46bov-Bindung minimal benötigte Sequenz innerhalb des NADL E2 auf die Aminosäuren 57-293 eingeengt werden. Darauf basierend wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss dieser Aminosäuren auf die Rezeptorbindung näher untersucht, um die für die E2-CD46bov-Interaktion benötigte Sequenz weiter einschränken zu können. Die Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt:1. Es wurden 24 NADL/ Alfort E2-Chimären hergestellt und deren Bindung an CD46bov im Zelladsorptionstest getestet. Dabei konnten im NADL E2 vier Peptidsequenzen (Y55LQRCTRET63, H179NcI182, E245gvAiVPQgTLK256 und Q265vIaMdTK272) identifiziert werden, deren Austausch gegen die analogen Aminosäuren des Alfort E2 zu einem Verlust der Bindung an CD46bov führte. Die Insertion dieser vier potentiellen Bestandteile der Rezeptorbindungsdomäne in das Alfort E2 vermittelte jedoch keine Interaktion mit CD46bov.2. Die Etablierung eines Zell-ELISAs ermöglichte die Quantifizierung der Bindung zwischen CD46bov und den chimären E2 Proteinen unter Berücksichtigung der E2-Expression. Dazu wurde das lösliche Fusionspeptid CD46bov-Fchum hergestellt, angereichert und aufgereinigt sowie dessen Menge bestimmt. Die Bindungsspezifität des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie, in Infektionsstudien und im ELISA überprüft. 3. Der Zell-ELISA ermöglichte die Identifikation vier weiterer Peptidsequenzen, deren Austausch zu einer Abnahme der CD46bov-Bindungsaktivität unter 35% führte. Es wäre denkbar, dass eine oder mehrere dieser Aminosäureabschnitte an der Bildung der CD46bov-Bindungsdomäne mitbeteiligt sind. Eine Steigerung der CD46bov-Bindungsaktivität konnte beobachtet werden, nachdem die beiden zwischen NADL und Alfort E2 nicht konservierten Cysteine ausgetauscht wurden. Hingegen hatte die Insertion zweier zusätzlicher potentieller N-Glykosylierungsstellen keine bzw. eine mäßige Reduktion der Rezeptorbindung zur Folge. 4. Die Peptidsequenzen Y55LQRCTRET63, H179NcI182, E245gvAiVPQgTLK256 und Q265vIaMdTK272 konnten auf die für die CD46bov-Bindung essentiellen Aminosäuren Q57RCTRET63, H179N180, A248iVPQgTL255 und I267aM269 eingegrenzt werden. Beim Sequenzvergleich dieser Abschnitte mit den analogen Aminosäuren verschiedener BVDV und KSPV-Stämme wurden vorwiegend Ladungsunterschiede festgestellt, welche vermutlich für das unterschiedliche Bindungsverhalten von KSPV und BVDV E2 an CD46bov verantwortlich sind.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2009