Untersuchungen zur Optimierung der Kryokonservierung caniner Spermien unter besonderer Berücksichtigung verschiedener Verdünner
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Zusammenfassung
Untersuchungen zur Optimierung der Kryokonservierung caniner Spermien unter besonderer Berücksichtigung verschiedener Verdünner Die Kryokonservierung von Rüdensperma gewinnt durch den stetig steigenden Einsatz der künstlichen Besamung zunehmend an Bedeutung. Zahlreiche kommerzielle und nicht-kommerzielle Verdünner-Systeme sind bereits beschrieben und verfügbar. Ziel dieser Studie war es, drei verschiedene Verdünner, zwei selbst hergestellte Tris-Eidotter-Verdünner (TE und Uppsala Equex System 2, Up, nach Linde-Forsberg, 2001) sowie den kommerziellen CaniPRO Freeze A& B Verdünner (CP), bezüglich ihrer Eignung für die Kryokonservierung von caninem Sperma sowie für den Einsatz im täglichen Kliniks-Alltag zu untersuchen. Des Weiteren wurde der Zusatz eines Auftaumediums (UpA, Auftaumedium des Uppsala Equex Systems 2 nach Linde-Forsberg, 2001) zur Verbesserung der Spermaqualität untersucht. Mittels digitaler Manipulation wurden 30 Ejakulate fraktioniert von zehn gesunden Rüden verschiedener, großer Rassen sowie 3 Ejakulate von einem Rüden (Sonderfall) mit benigner Prostatahyperplasie, Prostatazysten und chronischer Prostatitis gewonnen. Unmittelbar an die Gewinnung wurde die spermienreiche Fraktion makroskopisch (Volumen, Farbe, Geruch, Konsistenz, Beimengungen), chemisch-physikalisch (pH-Wert) und mikroskopisch untersucht. Die mikroskopische Untersuchung schloss eine Dichtebestimmung mittels SpermaCue® zur Berechnung der Gesamtspermienzahl und eine subjektive Beurteilung von Gesamt- (GM) und Progressivmotilität (PM), Lebend-Tot-Anteil, Anteil morphologisch veränderter Spermien (Eosin-Ausstrich), akrosomalem Status (Spermac®-Färbung) und Membranintegrität (HOS-Test) ein. Ergänzend wurde eine computerassistierte (CASA) Motilitäts- (GMCASA, PMCASA) und Viabilitätsanalyse (SYBR14/PI) mittels SpermVision® (Minitüb) durchgeführt. Die spermienreiche Fraktion wurde in drei Aliquots aufgeteilt und mit einem der drei Verdünner (TE, UP, CP) aufgearbeitet und nach entsprechender Equilibrierung bei 4°C in Midipailletten eingefroren. Unmittelbar vor dem Einfrieren erfolgte eine erneute Untersuchung eines Aliquots, um die Unterschiede zwischen Nativsperma und vollständig aufgearbeitetem Sperma vor Kryokonservierung festzuhalten. Weitere Untersuchungen wurden direkt nach dem Auftauen (60 Sekunden, 37°C) sowie nach 10, 30 und 60 Minuten durchgeführt. Zudem wurde unmittelbar nach dem Auftauen ein Aliquot 1:1 mit Auftaumedium versetzt und ebenso untersucht. Im Nativsperma wurden folgende Befunde erhoben: Gesamtspermienzahl 894,8 ± 150,3 Mio., PM 80,0 ± 4,8 %, GMCASA 78,2 ± 7,9 %, PMCASA 70,6 % (+ 8,0;- 8,7); Lebend-Tot-Anteil 87,7 ± 2,8 %, Viabilität 85,9 ± 5,7 %, morphologisch veränderte Spermien 11,7 ± 4,6 %, Kappenverluste 0,1 % (+ 0,3; 0), nicht aufgerollte Geißel im HOST 4,7 ± 0,1 %.Nach vollständiger Aufarbeitung, jedoch vor Kryokonservierung war in mit CP-aufgearbeiteten Proben die geringste Beeinflussung der Motilitätsparameter, in mit TE-aufgearbeiteten Proben die größte Beeinflussung nachweisbar. Nach der Kryokonservierung war die Motilität in Up-Proben am höchsten (GM 60,5 ± 7,0 %, PM 50,5 ± 13,4 %, GMCASA 50,1 ± 13,9 %, PMCASA 37,0 % (+ 13,8; - 12,8)) verglichen mit CP-verdünnten Ejakulaten (GM 49,8 ± 12,6 %, PM 41,7 ± 15,2 %, GMCASA 28,9 ± 10 % , PMCASA 17,2 % (+ 10,8; - 8,6)) und TE-aufgearbeiteten Proben (GM 32,0 ± 13,3 %, PM 20,4 ± 13,4 %, GMCASA 21,8 ± 5,7 %, PMCASA 10,2 % (+ 6,7; - 5,2)). Die Geschwindigkeits- und Streckenparameter (VSL 48,5 ± 8,2; VCL 93,5 ± 11,6; VAP 58,0 ± 8,7; DSL 20,5 ± 3,4; DCL 39,8 ± 4,7; DAP 24,5 ± 3,6) waren jedoch in CP-Proben am höchsten. Der mittlere Anteil morphologisch veränderter Spermien lag bei 17,2 ± 8,7 % (Up), 14,1 ± 8,4 % (CP) und 19,8 ± 9,6 % (TE).Während der Inkubation bei 37°C waren die Viabilitätsverluste und die Abnahme des Anteils lebender Spermien in mit Up-versetzten Proben am geringsten.Der Zusatz von Auftaumedium führte insbesondere zu einer subjektiven Verbesserung der Motilität, zu höheren Strecken- und Geschwindigkeitsparametern sowie zu einer erhöhten Viabilität (CP, Up).Anhand der vorliegenden Ergebnisse konnte eine deutliche Überlegenheit der zweiphasigen Up- und CP- Verdünner im Vergleich zum einphasigen TE-Verdünner gezeigt werden, was ihren Einsatz im Kliniks-Alltag bei nur geringgradig höherem Zeitaufwand rechtfertigt. Während nach dem Auftauen GM und PM beim Up-Verdünner am höchsten waren, zeichnete sich der CP-Verdünner durch die höchsten Geschwindigkeits- und Streckenparameter sowie den geringsten Anteil an morphologisch veränderten Spermien aus. Welcher dieser Untersuchungsparameter einen entscheidenderen Einfluss auf die Fertilität hat, bedarf weiterer in vivo bzw. in vitro Untersuchungen.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler