Charakterisierung der Tollwutvakzinen "Rabipur" und "Rabivac" und der enthaltenen Virusstämme FluryLEP und PM 1503
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Zusammenfassung
Tollwut ist eine zoonotische Viruserkrankung, die in ungeimpften Wirten fast immer tödlich verläuft. Zurzeit zugelassene Impfstoffe zur Anwendung beim Menschen basieren überwiegend auf gereinigten inaktivierten Virionen, die über Zellkulturen gewonnen wurden. Diese Vakzinen gelten als sicher und wirksam, allerdings treten nach Immunisierung in einigen Fällen Nebenwirkungen auf.In der vorliegenden Arbeit wurden zwei für die Tollwutprophylaxe des Menschen zugelassene Impfstoffe, "Rabipur" und "Rabivac", charakterisiert. Während die Vakzine "Rabipur" den Tollwutvirusstamm FluryLEP beinhaltet, basiert die Vakzine "Rabivac" auf dem Stamm PM 1503. Analysen der genetischen Heterogenität der genannten Virusstämme im Vergleich mit anderen Impfstämmen zeigten Homologien auf Basis der Nukleinsäuren zwischen 90,23 % und 99,47 %. Die wichtigsten viralen Proteine, die Schutz von einer Erkrankung an Tollwut induzieren, sind das Nukleoprotein und das Glykoprotein. Die Analysen der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigten mit jeweils fast 100 % eine hohe Homologie des Nukleoproteins beider Stämme zu anderen Impfstämmen und damit eine Sequenzkonservierung der Antigenregionen. Im Gegensatz dazu wurden nach Vergleich der Glykoproteinsequenzen mehrere Aminosäurenaustausche in Antigenregionen sowie Variationen in Anzahl und Lokalisierung potenzieller N-Glykosylierungsstellen gefunden. Diese Veränderungen können Unterschiede zwischen den Tollwutvirusstämmen im Hinblick auf ihre immunologische Kreuzreaktivität einschließlich Kreuzneutralisation erklären.Zur biochemischen Charakterisierung wurden das Nukleo- und das Glykoprotein der Virusstämme FluryLEP und PM 1503 im Baculovirus-System exprimiert und nach Reinigung zur Gewinnung polyklonaler Seren verwendet. Nach Charakterisierung der Seren mittels Immunoblot, Immunfluoreszenz und Neutralisationstest wurden diese für die Etablierung von Sandwich ELISAs zur Quantifizierung des Nukleoproteins (N-ELISA) und des Glykoproteins (G-ELISA) verwendet. Die Integrität der Viruspartikel, eine entscheidende Determinante für die Potenz von Impfstoffpräparationen, wurde direkt in der Immunelektronenmikroskopie sowie indirekt mit Hilfe der etablierten ELISA-Verfahren untersucht. Das Nukleoprotein ist im Inneren von Virionen lokalisiert und somit bei intakten Partikeln für Antikörper nicht zugänglich. Durch Freisetzung des Nukleoproteins und weitere Analysen der Proben im ELISA konnte gezeigt werden, dass ungefähr 90 % dieses viralen Proteins nicht zugänglich für Antikörper war und somit wahrscheinlich als Teil von Viruspartikeln vorlag. Elektronenmikroskopisch ließen sich intakte und defekte Virionen nachweisen. Somit liefern diese Ergebnisse eine Erklärung für den Nachweis von Tollwutvirusnukleoprotein mittels des N-ELISAs in nativen Impfstoffpräparationen. Weiterhin wurde die Proteome der Impfstoffpräparationen charakterisiert. Virale und nicht virale Proteine ließen sich mit Hilfe verschiedener Verfahren wie Immunoblot, N-terminale Peptid-Sequenzierung sowie MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation time-of-flight Mass Spectrometry) identifizieren. Die viralen Nukleo-, Glyko-, Matrix-, Phospho- und Largeproteine wurden in dem Impfstoff "Rabipur" und, mit Ausnahme des Phosphoproteins, auch in dem Impfstoff "Rabivac" nachgewiesen. Zusätzlich konnten sechs nicht virale Proteine als Bestandteile der Impfstoffe identifiziert werden. Die Serumproteine Albumin und Haptoglobin wurden als Hauptverunreinigungen in beiden Vakzinen gefunden. In dem Impfstoff "Rabipur" wurden zusätzlich Hemopexin, Actin, Alpha-1b-Glykoprotein und Afamin nachgewiesen.Die hier vorgestellten Ergebnisse beinhalten eine umfassende Charakterisierung von zwei Tollwutimpfstoffen auf morphologischem, molekularem und biochemischem Niveau. Hieraus lassen sich Möglichkeiten zur Optimierung der Qualitätskontrolle ableiten; die Analysen legen nahe, dass die Integrität von Viruspartikeln in Tollwut-Impfstoffpräparationen beurteilt werden sollte.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
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Anmerkungen
Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler 2009