Etablierung und Charakterisierung eines in vivo RNA-Rekombinationssystems : Mechanistische Studien und Erzeugung rekombinanter Pestiviren
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Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit konnte das erste Zellkultursystem für die pestivirale RNA-Rekombination etabliert werden. Es stellt im Vergleich zur alleinigen Sequenzanalyse natürlich entstandener rekombinanter Pestivirusgenome einen erheblichen Fortschritt dar. Das System erlaubt nach Transfektion eines nicht replikationskompetenten Transkripts in mit nichtzytopathogenem (nzp) Virus infizierte Zellen und auch nach Kotransfektion von zwei synthetischen RNAs in nicht infizierte Zellen die effiziente Generierung rekombinanter Pestiviren. Dieser Versuchsansatz ahmt in Zellkultur die Entstehung von zytopathogenen (zp) Genomen des Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV) im Tier nach. Er erlaubte es, bereits zuvor aufgestellte Arbeitshypothesen wie die Abhängigkeit der RNA-Rekombinationsfrequenz von der zur Verfügung stehenden Menge eines Rekombinationspartners zu bestätigen. Ausserdem zeigte die Analyse von 46 crossover -Regionen, die jeweils durch Rekombination zwischen demselben Paar von parentalen RNAs entstanden waren, eine mögliche Beteiligung von Basenpaarung an einem hypothetischen, replikativen Rekombinationsprozess. Dabei konnte unter anderem das bislang größte pestivirale Genom identifiziert werden, dessen Länge die eines nzp Virus um fast 60 % übertrifft. Weitere Untersuchungen zum Mechanismus der RNA-Rekombination deuteten darauf hin, dass zumindest in diesem System RNA-Rekombination hauptsächlich in den ersten Stunden nach der Transfektion synthetischer RNAs stattfand. Desweiteren scheint replikative RNA-Rekombination von Pestiviren nicht (oder nur sehr eingeschränkt) während der viralen Plusstrangsynthese stattzufinden. Es konnte auch gezeigt werden, dass der pestivirale Replikationskomplex die Plusstrangsynthese am 3´-Ende eines (synthetischen) Minusstrangs in trans nicht initiieren kann. Die Möglichkeit zur gezielten Beeinflussung beider Rekombinationspartner erlaubte Studien, welche die Unabhängigkeit der RNA-Rekombination von der autonomen Replikationskompetenz beider Rekombinationspartner beweisen. Dabei konnten einzigartige rekombinante nzp BVD-Viren isoliert werden. Über die Bestimmung der Herkunft der 3´NTR rekombinanter viraler Genome wurde für das Rekombinationssystem ein doppelter 'template switch' zwischen den eingesetzten Rekombinationspartnern während der viralen Minusstrangsynthese ausgeschlossen. Als wichtigstes Ergebnis belegen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Versuche, dass in der Zelle ein bislang nicht näher charakterisierter Mechanismus für die Rekombination von RNAs existiert, der von der Anwesenheit einer viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) unabhängig ist. Eine End- zu Endligation der beteiligten Rekombinationspartner scheint dabei keine Rolle zu spielen. Die weitreichende Bedeutung dieses Phänomens für die Evolution und Zellbiologie ist noch nicht abzusehen. Das Rekombinationssystem wurde zur Klärung der Frage eingesetzt, ob die Entstehung eines von einem Helfervirus unabhängigen zp Genoms des Virus der klassischen Schweinepest (KSPV) durch RNA-Rekombination möglich ist. Ein solches KSPV war bislang weder aus infizierten Tieren noch aus Zellkulturpassagen eines nzp Virus isoliert worden. Durch erfolgreiche Adaptation des Rekombinationssystems an KSPV konnte das von einem Helfervirus unabhängige zp KSPV (CP G1) erzeugt werden. Exemplarisch wurde für CP G1 gezeigt, dass Helfervirus-unabhängige zp Stämme für eine vereinfachte Durchführung von Serumneutralisationstests in der KSPV-Diagnostik geeignet erscheinen. Zusammengefasst zeigt diese praktische Anwendung, dass das vorliegende Rekombinationssystem als Alternative zum klassischen Mutationsweg über reverse Genetik ein flexibel einsetzbares Wekzeug darstellt. Dieses System kann u.a. zur Generierung rekombinanter (Pesti)-Viren von erwünschtem Phänotyp (z.B. von zp Genomen) sowie zur gezielten Mutation definierter Bereiche eines viralen Genoms (z.B. von RdRp-Mutanten) eingesetzt werden.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
Beschreibung
Anmerkungen
Erstpublikation in
Wettenberg : VVB Laufersweiler 2005