New molecular insights into sperm epigenetics: regulation of LINE-1 elements by CpG methylation and histone-modifications, and its impacts on sperm quality
Zuvor haben wir im menschlichen Spermium gezeigt, dass die Mehrheit der verbleibenden Nukleosomen an repetitiven DNA-Elementen wie L1 und SINEs angereicht ist. L1 ist das einzig aktive Retrotransposon und nimmt etwa 17 % des menschlichen Genoms ein. L1-Aktivitäten können zur Mutagenese, genomischen Instabilität und Tumorprogression beitragen. Mechanismen, die speziell auf die L1-Suppression bei Spermien abzielen, sind noch unbekannt. In somatischen Zellen ist bekannt, dass L1 durch CpG-Methylierung und jeweils durch DNA Methyltranferasen (DNMT1 und DNMT3A), spezifische Transkriptionsfaktoren (YY1, SIRT6, MORC2) und bestimmte Histonmarkierungen, insbesondere H4K20me3 reguliert wird. Vor kurzem hat unsere Gruppe durch genomweite ChIP-Sequenzierung identifiziert, dass H4K20me3 in L1-Elementen von menschlichen Spermien hoch angereichert vorliegt. (Ozturk et al., 2019 eingereicht). H4K20me3 zusammen mit H4K20me2 sind die am häufigsten vorkommenden Histonmodifikationen in menschlichen Spermien (80.9 %, 9.8 %; jeweils), wobei H4K20me3 diejenige war, welche die höchste Anreicherung im Übergang von runden zu elongierenden Spermien aufwies. Die H4K20-Methylierung wird durch spezifische Histonmethyltransferasen vermittelt, nämlich KMT5A, KMT5B und KMT5C.Das Ziel dieser Arbeit war es, Erkenntnisse über die epigenetische Regulation von L1 in Spermien zu gewinnen und dessen Auswirkungen auf die männliche Subfertilität aufzuzeigen. Daher wurden die Methylierung und mRNA von L1 in Spermien von fertilen Männern analysiert und mit denen von subfertilen Patienten verglichen, die mit ihren weiblichen Partnern eine ART durchgeführt haben. Da die weiblichen Partner unauffällig waren, wurde von einem männlicher Faktor Unfruchtbarkeit/Subfertilität angenommen. Darüber hinaus wurden auf der Grundlage von Erkenntnissen aus Studien in somatischen Zellen in beiden Kohorten auch bekannte epigenetische Modifikatoren und Regulatoren von L1 analysiert. Um ein Zellmodell für eine unzureichende Spermatogenese bzw. defektes Sperma zu haben, wurden auch immotile Spermien aus Samen gesunder Spender in diese Studie einbezogen. Die wichtigsten Ergebnisse werden im Folgenden dargestellt:Die Spermien subfertiler Patienten besaßen im Vergleich zu gesunden Spendern signifikant niedrigere DNMT1- und DNMT3A-mRNA-Spiegel;Die globalen DNA- und RNA-Methylierungswerte unterschieden sich nicht in motilen Spermien von gesunden Spendern und subfertilen Patienten;Im Vergleich zu den motilen und immotilen Spermien gesunder Spender war eine signifikant verminderte L1-Methylierung bei motilen Spermien subfertiler Patienten nachweisbar. Bei den motilen Spermien von Patienten und Spendern waren L1-mRNA und -Methylierung signifikant negativ korreliert. Darüber hinaus wurde in der Patientenuntergruppe, die eine positive Schwangerschaft nach ICSI zeigte, eine signifikante Korrelation von L1-Methylierung und Befruchtungsrate festgestellt. Interessanterweise besaßen immotile Spermien von gesunden Spendern signifikant erhöhte L1-mRNA-Spiegel;SIRT6, ein Transkriptionsfaktor, der sich als epigenetisch herunterreguliert bei alternden menschlichen dermalen Fibroblasten erwiesen hat, wurde in menschlichen Samenzellen untersucht. SIRT6-Promotor-Hypermethylierung wurde in Spermien von subfertilen Patienten gefunden. In Spermien wurde die SIRT6-Methylierung durch das Alter nicht beeinflusst. Ein weiterer L1-Transkriptionsfaktor, MORC2, wurde auf dem niedrigsten mRNA-Spiegel in immotilen Spermien gesunder Spender gefunden. Im Gegensatz dazu wurde der L1-Transkriptionsfaktor YY1 ausschließlich in menschlichen Sertoli-Zellen gefunden, nicht aber in männlichen Keimzellen;L1-Repressoren, H4K20me2 und H4K20me3, waren im Hodengewebe von Menschen, Maus und Bulle allgegenwärtig exprimiert, wobei die H4K20me2-Signale in früheren spermatogenetischen Phasen (Spermatogonien/Spermatozyten) ausgeprägter waren und die von H4K20me3 in späteren Phasen (runde/elongierende Spermatozoen). Sowohl in motilen als auch in immotilen Spermien gesunder Spender wurden H4K20me2 und H4K20me3 einbehalten. Der Vergleich der H4K20me3-Signale zeigte eine höhere Anreicherung in immotilen Spermien. Genomweite H4K20me3-Bindungsstellen, die kürzlich durch ChIP-Sequenzierung in beweglichen menschlichen Spermien entdeckt wurden, konnten hier für einige ausgewählte Gene bestätigt werden (L1, CXCL8, TNSFS13B, IFNW1 und CST8);Die mRNAs der H4K20-Methyltransferasen KMT5A und KMT5B wurden in motilen und immotilen menschlichen Spermien gefunden. Im Gegensatz dazu waren KMT5C-mRNA und -Protein in menschlichen Spermien nicht detektierbar.
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