New molecular insights into sperm epigenetics: regulation of LINE-1 elements by CpG methylation and histone-modifications, and its impacts on sperm quality

Abstract

Zuvor haben wir im menschlichen Spermium gezeigt, dass die Mehrheit der verbleibenden Nukleosomen an repetitiven DNA-Elementen wie L1 und SINEs angereicht ist. L1 ist das einzig aktive Retrotransposon und nimmt etwa 17 % des menschlichen Genoms ein. L1-Aktivitäten können zur Mutagenese, genomischen Instabilität und Tumorprogression beitragen. Mechanismen, die speziell auf die L1-Suppression bei Spermien abzielen, sind noch unbekannt. In somatischen Zellen ist bekannt, dass L1 durch CpG-Methylierung und jeweils durch DNA Methyltranferasen (DNMT1 und DNMT3A), spezifische Transkriptionsfaktoren (YY1, SIRT6, MORC2) und bestimmte Histonmarkierungen, insbesondere H4K20me3 reguliert wird. Vor kurzem hat unsere Gruppe durch genomweite ChIP-Sequenzierung identifiziert, dass H4K20me3 in L1-Elementen von menschlichen Spermien hoch angereichert vorliegt. (Ozturk et al., 2019 eingereicht). H4K20me3 zusammen mit H4K20me2 sind die am häufigsten vorkommenden Histonmodifikationen in menschlichen Spermien (80.9 %, 9.8 %; jeweils), wobei H4K20me3 diejenige war, welche die höchste Anreicherung im Übergang von runden zu elongierenden Spermien aufwies. Die H4K20-Methylierung wird durch spezifische Histonmethyltransferasen vermittelt, nämlich KMT5A, KMT5B und KMT5C.Das Ziel dieser Arbeit war es, Erkenntnisse über die epigenetische Regulation von L1 in Spermien zu gewinnen und dessen Auswirkungen auf die männliche Subfertilität aufzuzeigen. Daher wurden die Methylierung und mRNA von L1 in Spermien von fertilen Männern analysiert und mit denen von subfertilen Patienten verglichen, die mit ihren weiblichen Partnern eine ART durchgeführt haben. Da die weiblichen Partner unauffällig waren, wurde von einem männlicher Faktor Unfruchtbarkeit/Subfertilität angenommen. Darüber hinaus wurden auf der Grundlage von Erkenntnissen aus Studien in somatischen Zellen in beiden Kohorten auch bekannte epigenetische Modifikatoren und Regulatoren von L1 analysiert. Um ein Zellmodell für eine unzureichende Spermatogenese bzw. defektes Sperma zu haben, wurden auch immotile Spermien aus Samen gesunder Spender in diese Studie einbezogen. Die wichtigsten Ergebnisse werden im Folgenden dargestellt:Die Spermien subfertiler Patienten besaßen im Vergleich zu gesunden Spendern signifikant niedrigere DNMT1- und DNMT3A-mRNA-Spiegel;Die globalen DNA- und RNA-Methylierungswerte unterschieden sich nicht in motilen Spermien von gesunden Spendern und subfertilen Patienten;Im Vergleich zu den motilen und immotilen Spermien gesunder Spender war eine signifikant verminderte L1-Methylierung bei motilen Spermien subfertiler Patienten nachweisbar. Bei den motilen Spermien von Patienten und Spendern waren L1-mRNA und -Methylierung signifikant negativ korreliert. Darüber hinaus wurde in der Patientenuntergruppe, die eine positive Schwangerschaft nach ICSI zeigte, eine signifikante Korrelation von L1-Methylierung und Befruchtungsrate festgestellt. Interessanterweise besaßen immotile Spermien von gesunden Spendern signifikant erhöhte L1-mRNA-Spiegel;SIRT6, ein Transkriptionsfaktor, der sich als epigenetisch herunterreguliert bei alternden menschlichen dermalen Fibroblasten erwiesen hat, wurde in menschlichen Samenzellen untersucht. SIRT6-Promotor-Hypermethylierung wurde in Spermien von subfertilen Patienten gefunden. In Spermien wurde die SIRT6-Methylierung durch das Alter nicht beeinflusst. Ein weiterer L1-Transkriptionsfaktor, MORC2, wurde auf dem niedrigsten mRNA-Spiegel in immotilen Spermien gesunder Spender gefunden. Im Gegensatz dazu wurde der L1-Transkriptionsfaktor YY1 ausschließlich in menschlichen Sertoli-Zellen gefunden, nicht aber in männlichen Keimzellen;L1-Repressoren, H4K20me2 und H4K20me3, waren im Hodengewebe von Menschen, Maus und Bulle allgegenwärtig exprimiert, wobei die H4K20me2-Signale in früheren spermatogenetischen Phasen (Spermatogonien/Spermatozyten) ausgeprägter waren und die von H4K20me3 in späteren Phasen (runde/elongierende Spermatozoen). Sowohl in motilen als auch in immotilen Spermien gesunder Spender wurden H4K20me2 und H4K20me3 einbehalten. Der Vergleich der H4K20me3-Signale zeigte eine höhere Anreicherung in immotilen Spermien. Genomweite H4K20me3-Bindungsstellen, die kürzlich durch ChIP-Sequenzierung in beweglichen menschlichen Spermien entdeckt wurden, konnten hier für einige ausgewählte Gene bestätigt werden (L1, CXCL8, TNSFS13B, IFNW1 und CST8);Die mRNAs der H4K20-Methyltransferasen KMT5A und KMT5B wurden in motilen und immotilen menschlichen Spermien gefunden. Im Gegensatz dazu waren KMT5C-mRNA und -Protein in menschlichen Spermien nicht detektierbar. Previously we have shown in human sperm, that the majority of retained nucleosomes are enriched in repetitive DNA elements like L1 and SINEs. L1 is the only active retrotransposon and occupies about 17 % of the human genome. L1 activity can induce mutagenesis, genomic instability and tumor progression. Mechanisms specifically targeting L1 suppression in spermatozoa are still unknown. In somatic cells, L1 is known to be regulated by CpG methylation and, respectively DNA methyltransferases (DNMT1 and DNMT3A), specific transcription factors (YY1, SIRT6 and MORC2) and selected histone marks, predominantly H4K20me3. Recently, our group identified by genome-wide ChIP-sequencing, that H4K20me3 is highly enriched in L1 elements of human spermatozoa (Ozturk et al., 2019 submitted). H4K20me3 together with H4K20me2 were shown to be the most abundant histone modifications in human spermatozoa (80.9 %, 9.8 %; respectively), whereby H4K20me3 was the one, which had the highest enrichment in transition from round to elongating spermatids. H4K20 methylation is mediated by specific histone methyltransferases, namely KMT5A, KMT5B and KMT5C.The aim of this thesis was to gain insights about the epigenetic regulation of L1 in spermatozoa and to reveal its impact on male subfertility. Therefore, the methylation and mRNA of L1 were analyzed in spermatozoa of fertile men and compared to those in subfertile patients, who underwent ART with their female partners. As female partners were inconspicuous, a male factor infertility/ subfertility was presumed. Moreover, based on insights from studies on somatic cells, known epigenetic modifiers and regulators of L1 were also analyzed in both groups. In order to have a cell model for inappropriate spermatogenesis and defective sperm, respectively, immotile spermatozoa obtained from semen of healthy donors were also included in this study. The main results are presented below:Spermatozoa of subfertile patients possessed significantly decreased DNMT1 and DNMT3A mRNA levels in comparison to healthy donors;Global DNA and RNA methylation levels did not differ in motile spermatozoa of healthy donors and subfertile patients;Significantly decreased L1 methylation was detectable in motile spermatozoa of subfertile patients in comparison to healthy donors motile and immotile spermatozoa. Among patients and donors motile spermatozoa, L1-mRNA and -methylation were significantly negative correlated. Moreover, in the patient subgroup showing a positive pregnancy after ICSI, a significant correlation of L1 methylation and fertilization rate was revealed. Interestingly, immotile spermatozoa of healthy donors possessed significantly increased L1 mRNA levels;SIRT6, a transcription factor which was shown to be epigenetically downregulated in aging human dermal fibroblasts was observed in human sperm cells. SIRT6 promotor hypermethylation was found in spermatozoa of subfertile patients. In sperm cells SIRT6 methylation was not affected by age. Another L1 transcription factor, MORC2, was found at lowest at mRNA level in immotile spermatozoa of healthy donors. In contrast, the L1 transcription factor YY1 was exclusively found in human Sertoli cells, but not in male germ cells;Repressors of L1, H4K20me2 and H4K20me3, were found to be ubiquitously expressed in human, mouse and bull testis tissues, whereby H4K20me2 signals were more intense in earlier spermatogenetic stages (spermatogonia/spermatocytes) and H4K20me3 in later stages (round/elongating spermatids). In mature spermatozoa of healthy donors, H4K20me2 and H4K20me3 were retained in both motile and immotile ones. Comparison of H4K20me3 signals revealed their higher abundance in immotile spermatozoa. Genome-wide H4K20me3 binding sites, recently revealed by ChIP-sequencing in motile human spermatozoa, could be confirmed here for some selected genes (L1, CXCL8, TNSFS13B, IFNW1 and CST8);The mRNAs of H4K20 methyltransferases, KMT5A and KMT5B, were found in motile and immotile human spermatozoa. In contrast, KMT5C-mRNA and -protein were undetectable in human spermatozoa.