Beschreibung der intrazellulären Lokalisation der Wildtyp-RDH5 und mutierter RDH5 im Vergleich zum RLBP1
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Zusammenfassung
Der Retinolzyklus in den retinalen Pigmentepithelzellen dient der Wiederherstellung des Retinoids 11-cis-Retinal, das für den Sehvorgang des menschlichen Auges essentiell ist. Am Retinolzyklus sind die Proteine RDH5 und RLBP1 beteiligt, die miteinander interagieren. Mutationen im RDH5-Gen führen zu einer verminderten Produktion des Retinoids 11-cis-Retinal und einer Akkumulation der Vorstufe 11-cis-Retinol, welches zu 11-cis-Retinylestern verstoffwechselt wird, die vermutlich in Retinosomen gespeichert werden. Phänotypisch äußert sich die Mutation im RDH5-Gen durch weiße Flecken am Fundus der Patienten, dem Fundus albipunctatus, der zur Nachtblindheit führt. Ziel dieser Arbeit war es zu überprüfen, ob die mutierte RDH5 eine veränderte intrazelluläre Lokalisation im Vergleich zur Wildtyp-RDH5 besitzt, die eine Interaktion mit RLBP1 verhindern würde und so für die verminderte Produktion des Retinoids 11-cis-Retinal verantwortlich sein könnte. In dieser Arbeit wurden die beiden Punktmutationen p.G238W und p.A294P im RDH5-Gen auf molekularer Ebene untersucht. Zunächst wurde mittels RT-PCR die DNA des RDH5- und RLBP1-Gens aus humaner RNA gewonnen. Die Gene wurden zuerst in pCR®2.1-TOPO®-Vektoren und anschließend in pcDNA3.1+-Expressionsvektoren kloniert. Durch eine Mutagenese-PCR wurden die Punktmutationen p.G238W und p.A294P in das RDH5-Gen eingefügt. Die heterologe Expression der Wildtyp-Gene und der mutierten RDH5-Gene wurde in der humanen HEK293T-Zelllinie überprüft. Nachdem die dortige Expression gelungen war, wurde die intrazelluläre Lokalisation der Proteine in HeLa-Zellen untersucht. Die Lokalisation der RDH5-Mutanten wurde mit der der Wildtyp-RDH5 verglichen. Sowohl die RDH5-Mutanten als auch die Wildtyp-RDH5 zeigten ein perinukleär akzentuiertes, gleichmäßiges, feinfleckiges Verteilungsmuster, das mit einer Lokalisation der RDH5 am Endoplasmatischen Retikulum vereinbar war. Im Gegensatz zur Wildtyp-RDH5 konnte bei den mutierten RDH5G238W und RDH5A294P jedoch zudem eine Akkumulation immunpositiven Materials im Bereich der Plasmamembran gezeigt werden. Aufgrund dessen wurde in dieser Arbeit die Vermutung aufgestellt, dass die mutierte RDH5 bevorzugt in der Plasmamembran und an den Retinosomen, die bei einer Mutation im RDH5-Gen vermehrt hergestellt werden, lokalisiert ist. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die intrazelluläre Lokalisation der Wildtyp-RDH5 und der RDH5-Mutanten mit der Lokalisation des RLBP1 verglichen. Die intrazelluläre Lokalisation von RLBP1 zeigte eine perinukleär betonte, netzartige Verteilungsstruktur und wurde dem Zytoskelett zugeordnet. Aufgrund der überlappenden intrazellulären Lokalisation wurde eine Interaktion zwischen der Wildtyp-RDH5 und dem RLBP1 ebenso wie zwischen den RDH5-Mutanten und dem RLBP1 am Endoplasmatischen Retikulum für möglich gehalten.Verknüpfung zu Publikationen oder weiteren Datensätzen
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Erstpublikation in
Giessen : VVB Laufersweiler