Lys 691 , a predicted phosphate coordination site, and Asp 714 , a predicted water coordination site of the sodium pump a alpha subunit are essential for enzyme activity
Die Natriumpumpe, eine P-Typ-ATPase, scheint zur Superfamilie der Hydrolysen zu gehören.Aufgrund ihrer Faltungsstruktur müßte sie alsL-2-Haloazid-Dehalogenase klassifiziert werden. In der Haloazid-Dehalogenase L-2-DEX YL dient die Aminosäure Lys151 derStabilisierung der überschüssigen negativen Ladung bei der Substratbindung bzw. der Entstehung von Reaktions-Zwischenprodukten.Asp180 koordiniert ein Wassermolekül, welches direkt bei der Hydrolyse des Ester-Intermediats beteiligt ist. Die beiden Aminosäurenkönnte Lys691 und Asp714 der Natriumpumpe entsprechen. Um ihre Bedeutung für die Katalyse zu untersuchen, wurden Mutanten dieserAminosäuren in Hefezellen exprimiert und ihre Eigenschaften untersucht.
Die Mutationen Lys691Ala, Lys691Asp, Asp714Ala, und Asp714Arg waren völlig inaktiv. Die konservativen Mutanten Lys691Arg undAsp714Glu zeigten einige Teil-aktivitäten des Wildtyp-Enzyms, waren aber ohne ATPase-Aktivität. In Anwesenheit von Pi und Mg 2+ zeigtekeine der Mutanten eine Ouabainbindung: Der [E2*P·ouabain] Komplex konnte bei keiner der Mutanten gebildet werden. Ohne Zugabe vonMg 2+ zeigten die Lys691Asp- und Asp714Glu-Mutanten jedoch eine Ouabainbindung bei 5 mM Pi. Somit bewirkte Mg 2+ eine Reduktionder Ouabainbindung.
Hefezellen, welche die Mutanten Lys691Arg oder Asp714Glu exprimierten, waren sensitiv gegenüber Palytoxin und verloren K + . IhreSensitivität gegenüber Palytoxin, mit einem EC50 Wert von 118 ± 24 nM bzw. 76,5 ± 3,6 nM war deutlich reduziert und lag sieben- bzw.vierfach unter der Sensitivät von Hefezellen, die den Wildtyp exprimierten (17,8 ± 2,7 nM). Dieser Palytoxin-induzierter K + -Efflux wurdedurch Ouabain gehemmt. Der EC50 Wert für den Ouabaineffekt betrug 131 ± 13 µM bei der Lys691Arg Mutanten und war 2,5 mM odergrößer bei der Asp714Glu Mutanten. Der entsprechende EC50 Wert nicht-mutierter Natriumpumpen lag bei 5.13 ± 0.71 µM.
Isotopenaustauschexperimente mit 18 O-markiertem Pi zeigten bei der Mutanten Asp714Glu nur einen geringen 18 O Austausch mit demUmgebungswasser (H2 16 O) und keinen 18 O Austausch bei der Lys691Arg Mutante.
Schlussfolgernd, Lys691 und Asp714 sind sehr wichtig für die Konformationsübergänge der Natriumpumpe. Das Lys691 ist wichtig für denPhosphorylierungsprozess, Asp714 für den Dephosphorylierungsprozess. Beide Aminosäuren Lys691 und Asp714 der alpha Untereinheitder Natriumpumpe sind hier als essentiell für die enzymatische Aktivität nachgewiesen worden.
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