Alters- und genotypbedingte Änderungen der Neuropeptidexpression im Hypothalamus von Wildtypen und Melanokortin-4 Rezeptor-defizienten Mäusen

Abstract

In extrem adipösen Patientenkollektiven wurde bei etwa 2-4% der Probanden eine Mutation des Melanokortin-4 Rezeptor Gen (MC4r) nachgewiesen, die zu einer Haploinsuffizienz des Melanokortin-4 Rezeptors (MC4R) führt. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel eines korrespondierenden Tiermodells ein möglicher Einfluss von Alter und Genotyp auf die komplexe neuronale Kontrolle des Energiehaushaltes im Hypothalamus untersucht. Die untersuchten Mäuse besitzen aufgrund eines genetischen Defektes am MC4r keine funktionellen MC4R (MC4R-defiziente Mäuse). Die Expression verschiedener Neuropeptide wurde im Zielgebiet des lipostatischen Hormons Leptin, dem Nukleus arcuatus (ARC), und in den dem ARC nachgeschalteten Kerngebieten des ventromedialen (VMN) und dorsomedialen (DMN) Hypothalamus ermittelt und mit physiologischen Parametern korreliert. Die Neuropeptidexpression im ARC wird bis zu einem Alter von 56 Tagen wesentlich stärker von Körperfettgehalt bzw. Plasmaleptinkonzentration als von Genotyp und Alter bestimmt. Die Neuropeptid Y (NPY)- bzw. Agouti-related protein (AGRP) Expression sinkt, während die Pro-Opiomelanokortin (POMC)- bzw. Cocaine-and-Amphetamine-regulated Transcript (CART) Expression mit zunehmendem Körperfettgehalt bzw. steigender Plasmaleptinkonzentration ansteigt. Die orexigenen Peptide werden also entgegengesetzt zu den anorexigenen Peptiden beeinflusst. 9 Monate alte Tiere zeigen hingegen keine signifikante Korrelation zwischen der NPY Expression und den untersuchten Parametern. Nach Herauspartialisieren des Körperfettgehaltes beeinflusst der Genotyp am MC4r die Expression aller vier Neuropeptide bei Tieren bis zu einem Alter von 56 Tagen signifikant. Bei den 9 Monate alten Mäusen konnte lediglich ein signifikanter Genotypeinfluss auf die AGRP Expression nachgewiesen werden, wobei der Genotypeffekt umgekehrt zu dem der jüngeren Tiere ist. Die NPY Expression im Hypothalamus ist bei den jüngeren Tieren auf den ARC beschränkt, während sie bei den 9 Monate alten Mäusen auch im VMN und DMN nachweisbar ist. POMC und AGRP werden bei allen untersuchten Altersstufen ausschließlich im ARC exprimiert. Die nachgewiesene CART Expression im DMN wird durch Alter, Genotyp oder Körperfettgehalt der Tiere nicht beeinflusst. Die Anzahl der NPY-exprimierenden Neurone im VMN und DMN ist bei den 9 Monate alten Tieren positiv mit dem Körperfettgehalt und der Plasmaleptinkonzentration korreliert. Eine weitere Zunahme der NPY Expression im VMN und DMN wurde bei -/- Tieren nachgewiesen. Die induzierte NPY Expression im VMN und DMN ist vermutlich auf das Zusammenspiel verschiedener Faktoren zurückzuführen. Aufgrund des Körperfettgehaltes, des Genotyps und/oder des Alters kommt es bei der Neuropeptidexpression im ARC zu Verschie-bungen, die zusätzlich zu einer vorhandenen Leptinresistenz und zum MC4R Defekt die NPY Expression im VMN und DMN induzieren können. Neben den zellbiologischen Untersuchungen wurden Analysen systemphysiologischer Parameter an 9 Monate alten Wildtypen und MC4R-defizienten Mäusen durchgeführt. Diese system-physiologischen Daten wurden mit bereits veröffentlichten Ergebnissen von jüngeren Tieren (Weide et al., 2003) verglichen. 9 Monate alte Männchen aller drei Genotypen wiesen eine signifikant höhere Körpermasse und fettfreie Trockenmasse (FFDM) auf als die Weibchen. Während die männlichen 9 Monate alten Wildtypen höhere Werte für Körperfett aufwiesen als die Weibchen, war das Verhältnis bei den -/- Tieren umgekehrt. Dabei erreichte die Mehrzahl der -/- Weibchen einen maximalen Körperfettgehalt von ca. 60%. Diese Befunde unterscheiden sich von den Daten junger adulter Tiere. Ab einem Alter von 56 Tagen konnte bei fast allen untersuchten Parametern ein Gendosis-abhängiger Effekt auf die Körperzusammensetzung nachgewiesen werden. Im Alter von 35 Tagen zeigen -/- Tiere signifikante Unterschiede in der Körperzusammensetzung gegenüber den +/- und +/+ Tieren. Ein Geschlechtseinfluss lässt sich zwar bei MC4R-defizienten Tieren ab einem Alter von 21 Tagen nachweisen, es kommt jedoch im Gegensatz zu den älteren Tieren bis zu einem Alter von 2 Monaten zu keiner Interaktion zwischen Alter und Genotyp. Bei den jüngeren Tieren stieg die Plasmaleptinkonzentration proportional zur Körperfettmasse und zum Körperfettgehalt an. Bei den 9 Monate alten Männchen und Weibchen waren Körperfettmasse und Plasmaleptinspiegel proportional, Körperfettgehalt und Plasmaleptin-konzentration exponentiell korreliert. Nach Herauspartialisieren des Körperfettgehaltes wurde die Plasmaleptinkonzentration nur bei den 9 Monate alten Weibchen durch den Genotyp beeinflusst, die Plasmaleptinkonzentration von 9 Monate alten Männchen und jüngeren Tieren beiderlei Geschlechts erwies sich nach Herauspartialisieren des Körperfettgehaltes als Genotyp-unabhängig. Die Plasmainsulinkonzentration der 9 Monate alten Tiere zeigte bei Zunahme von Körperfettmasse und Körperfettgehalt einen exponentiellen Anstieg, diese in halb-logarithmischer Darstellung lineare Beziehung unterschied sich bei Männchen und Weibchen signifikant. Ein Einfluss des Genotyps auf die Plasmainsulinkonzentration konnte nicht nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine MC4R Defizienz einen Prozess einleitet, der mit zunehmendem Alter zu einer zunehmenden Entgleisung des zentralen Signalwegs im multifaktoriellen Kontrollsystem des Energiehaushaltes führt und sich dadurch letztendlich auf die Körperzusammensetzung von MC4R-defizienten Mäusen auswirkt. In several studies about 2-4% of extremely obese patients were found to have mutations in the melanocortin-4 receptor gene (MC4r), presumably leading to haploinsuffiency of the melanocortin-4 receptor (MC4R). We used the corresponding animal model to analyze the effects of age and genotype at MC4r on the complex neural circuits of energy balance control in the hypothalamus. In the present study on the MC4R-deficient mouse the neuropeptide expression in neurons of the arcuate nucleus (ARC), the primary neural target of the lipostatic hormone leptin, and the ventromedial (VMN) and dorsomedial hypothalamus (DMN), two downstream targets, were analyzed and then correlated with systemic parameters. Neuropeptide expression in the ARC of mice, up to 56 days of age, is influenced more by body fat content and plasma leptin levels than by age or genotype. The expression of neuropeptide Y (NPY) and Agouti-related protein (AGRP) is down-regulated, whereas the expression of pro-Opiomelanocortin (POMC) and Cocaine-and-amphetamine-regulated transcript (CART) is up-regulated with increasing body fat content. The expressions of the antagonistic peptides in the ARC are oppositely regulated in a counter-regulatory manner in relation to body fat content and plasma leptin levels. At the age of 9 months, however, neuropeptide expression is no longer significantly correlated with body fat content. After partializing out the influence of body fat content, genotype at MC4r significantly influences the expression of all four neuropeptides in the ARC in young mice, whereas in 9 month old mice genotype dependence is significant only for AGRP and, moreover, opposite in direction to that in younger animals. The expression of NPY is restricted to the ARC in 35-56 day old mice, but has expanded to the neighboring DMN and VMN at the age of 9 months. POMC and AGRP are not expressed in these nuclei up to this age, and the constitutive expression of CART in the DMN is not affected by age, fat content and genotype. Most importantly, at 9 months of age the number of NPY-expressing DMN and VMN neurons correlates positively with body fat content and plasma leptin concentration, i.e., the relationship is opposite to the negative feedback response found for NPY expression in the ARC of the younger mice. Moreover, an excess increase in the number of NPY-expressing DMN and VMN neurons is seen in the -/- mice. The cell biological data of the present study were combined with system physiological results of 9 month old wild type and MC4R-deficient mice, which were compared with system physiological results of published data from younger animals (Weide et al., 2003). 9 month old male animals of all three genotypes showed a significantly higher body mass and fat free dry mass (FFDM) than the females. While male wild types had higher body fat content than females it was opposite in the -/- animals. Most of the -/- females reached the maximum of 60% body fat content. These results were different from the data of the younger animals. By 56 days of age a gene-dosage dependent effect on nearly all investigated parameters were found, by 35 days of age the -/- mice showed significantly differences in body composition than +/- and +/+ animals. Although significant sex differences were observed from day 21 onward, no genotype x sex interactions were found. In younger animals plasma leptin concentration increased proportionally to body fat mass and body fat content, whereas in 9 month old male and female mice the increase of plasma leptin concentration was proportional to only body fat mass, whereas it was exponentially related to body fat content. After partializing out the influence of body fat content, plasma leptin concentration was affected by the genotype only in 9 month old females but not in males and in younger animals. In 9 month old animals plasma insulin concentration increased exponentially with both body fat mass and body fat content. This relationship was linear in a-semi-logarithmic plot and was significantly different in females and males. No genotype effect was found for the plasma insulin concentration. The present data suggest that MC4R deficiency initiates a lifelong process of deteriorating central signaling within the multi-factorial control system for energy balance with the consequence of changes in body composition of MC4R-deficient mice. Increasing age seems to affect this process and to enhance the massive fat deposition in 9 month old -/- mice.