Generation of novel inhibitor-variants for beta-beta-alpha-metal finger nucleases by evolution and rational protein design

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2010

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10155

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EndA ist eine unspezifische Nuklease, die auf der Oberfläche des pathogenen Bakteriums Streptococcus pneumoniae lokalisiert ist. Dort ist sie an der Fragmentierung doppelsträngiger DNA zu einzelsträngigen Segmenten beteiligt, die während kompetenter Phasen des Bakteriums aufgenommen werden. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass EndA effektiv das DNA Gerüst so genannter NETs (Neutrophil Extracellular Traps) degradiert. Mit diesen netzartigen Strukturen sind bakterizide Proteine wie Histone und Elastasen assoziiert, die zum Absterben gebundener Bakterien führen können. Mikroben, die durch den spezifischen DNA Abbau somit der Immunabwehr von Säugern entkommen, können schwere invasive Krankheiten auslösen.In dieser Arbeit wurden gezielt EndA Varianten mit Punktmutationen erzeugt, die das konservierte H-N-H/N Motiv betreffen. Die entsprechenden Varianten konnten aufgrund ihrer Toxizität nur mit Hilfe eines zellfreien Expressionssystems hergestellt werden. Allerdings konnte die inaktive Variante H160A in E. coli exprimiert und die nukleolytische Aktivität durch einen Überschuss an Imidazol im Reaktionspuffer wieder hergestellt werden (chemical rescue). Der Verlust der katalytischen Aktivität entstand durch den Austausch der generellen Base Histidin zu Alanin innerhalb des H-N-H/N Motivs. Des Weiteren konnte gezeigt werden, das Asparagin 182 (H-N-H/N) an der Stabilisierung des Proteins beteiligt ist, während Asparagine 192 das benötigte zweiwertige Metallion im aktiven Zentrum bindet (H-N-H/N). Bis heute wurde für die toxische Nuklease EndA kein Inhibitor entdeckt, der ein möglicher Ansatz für eine entsprechende Therapie für durch Streptokokken verursachte Krankheiten sein könnte. Allerdings sollte es möglich sein, basierend auf dem bekannten Inhibitor NuiA für die homologe Nuklease NucA einen funktionellen Inhibitor für EndA und andere homologe Nukleasen (Serratia Nuklease) herzustellen. Der in dieser Arbeit entwickelte Selektionsassay erwies sich allerdings als zu instabil, sodass kein Inhibitor isoliert werden konnte. Eine mögliche Alternative könnte ein yeast two-hybrid Assay sein, mit dessen Hilfe entsprechende NuiA Varianten aufgrund ihrer Interaktion mit EndA H160A isoliert und im Weiteren auf ihre inhibitorische Funktion überprüft werden könnten.

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