Expression von Inhibin und Aktivin im Hoden im Verlauf der Rekrudeszenz der Spermatogenese nach Downregulation mit einem GnRH-Implantat beim Rüden

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2016

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http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-11548

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Die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse ist für die neuroendokrine Regulation der Reproduktion verantwortlich. Infolge eines negativen Feedback-Mechanismus reguliert Testosteron die Gonadotropin-Sekretion (Luteinisierendes Hormon, LH, und Follikelstimulierendes Hormon, FSH). Die Feinregulation der FSH Sekretion erfolgt durch die Glykoproteine Aktivin (stimulierend) und Inhibin (hemmend) bzw. Follistatin (hemmend auf Aktivin), welche demnach einen gravierenden Einfluss auf die Kontrolle des Keimepithelzyklus ausüben.Ziel der Arbeit war es, die Expression von Aktivin und Inhibin im caninen Hoden zum Zeitpunkt der Downregulation infolge der Behandlung mit einem slow-release GnRH Agonist-Implantat und während der Rekrudeszenz der Spermatogenese näher zu charakterisieren. Hierzu wurden Untersuchungen zum Nachweis der drei Subunits Inhibin alpha, beta A und beta B, auf mRNA- und Proteinebene durchgeführt. Nach einer fünfmonatigen Behandlungsdauer mit einem Gonazon®-Implantat (18,5 mg Azagly-Nafarelin) wurden 37 adulte Beagle-Rüden in Gruppen von 3-4 Tieren in dreiwöchigem Abstand (Woche 0, 3, 6, 9, , 24) chirurgisch kastriert. Um den Einfluss des GnRH-Agonisten auf den Status der Downregulation näher zu untersuchen, wurden je drei Rüden mit einem 4,7 mg Deslorelin (Suprelorin®, SG)- Implantat bzw. einem 6,3 mg Buserelin-Implantat (Profact® Depot, PG) behandelt und nach fünf Monaten kastriert. Die Ergebnisse wurden mit einer adulten, unbehandelten Kontrollgruppe (n = 5, CG) sowie juvenilen Tieren (n = 3, JG) verglichen. Die Gruppeneinteilung der Hunde erfolgte zum einen anhand der Kastrationszeitpunkte (Woche 0, 3, 6, 9, 12, 24) und zum anderen anhand histologischer Kriterien, d. h. anhand der am weitesten entwickelten Keimzellen [DG A (Spermatozyten), DG B (runde Spermatiden), DG C (elongierende Spermatiden) und DG D (elongierte Spermatiden)].Auf mRNA-Ebene gelang mittels RT-PCR und qPCR in allen Gruppen zum Zeitpunkt der Downregulation und während der Rekrudeszenz der Spermatogenese, aber auch in der adulten und juvenilen Kontrollgruppe, der Expressionsnachweis aller drei Subunits. Für die alpha-Subunit konnten im Gruppen-Wochen Vergleich statistisch signifikante Unterschiede nachgewiesen werden (p = 0,0039), wobei die Expression in Wo 3 signifikant höher war als in Wo 9, 24 und in CG (p < 0,01-0,05). Beim Vergleich der downregulierten Tiere (Wo 0, SG, PG) mit der CG und JG waren ebenfalls signifikante Unterschiede verifizierbar (p = 0,0463), mit einer signifikant höheren Expression in SG verglichen mit CG (p < 0,05). Für die beta A-Subunit war zwischen den Wochen-Gruppen verglichen mit CG ein signifikanter Unterschied nachweisbar (p = 0,0026), wobei im Tukey-Test keine weiteren Signifikanzen verifiziert werden konnten, aber tendenziell die Expression in Woche 3 am höchsten war und dann bis Woche 24 abfiel. Die Expression der beta B-Subunit war beim Vergleich der DG mit CG signifikant verschieden (p = 0,0158), wobei sie bei DG A und B signifikant höher als in CG war (p < 0,05). Tendenziell konnte eine stete Abnahme der Expression auch im Wochen-Gruppen Vergleich gezeigt werden. Ebenso ergaben sich beim Vergleich der downregulierten Hoden mit CG und JG signifikante Differenzen (p = 0,0135) mit einer signifikant höheren Expression in Wo 0 und PG verglichen mit CG (p < ,05). Im Western Blot erwiesen sich die verwendeten Antikörper als spezifisch. In der Immunhistochemie zeigte sich auf Proteinebene für die Inhibin alpha-Subunit ein immunopositives Signal im Zytoplasma der Leydig- und Sertoli-Zellen. In den Sertoli-Zellen waren die immunopositiven Signale in DG B und JG besonders deutlich zu beobachten, während das Signal in CG am schwächsten war. Eine positive Farbreaktion zeigte sich für die beta A-Subunit in den peritubulären Zellen, den Sertoli-Zellen (außer Wo 0 und PG), Leydig-Zellen und Gonozyten (JG) bzw. Spermatogonien (außer DG D und CG). Für die Inhibin beta B-Subunit konnte bei allen Hunden eine Färbung der Gonozyten (JG) bzw. Spermatogonien und den je nach Entwicklungsstand der Spermatogenese weiter vorhandenen Keimzellen bis zu runden Spermatiden beobachtet werden.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Inhibin A und Aktivin A von Sertoli- und Leydig-Zellen produziert werden, Aktivin A zudem von peritubulären Zellen und Spermatogonien. Im Gegensatz dazu ist die Produktion von Aktivin B auf die Keimzellen beschränkt. Der erhöhte Nachweis von insbesondere Aktivin B zum Zeitpunkt der Downregulation und der frühen Rekrudeszenz deutet auf eine mögliche Rolle für die schnelle Aufregulation der Spermatogenese und auch das schnelle Anlaufen der Steroidbiosynthese hin. Den hohen Aktivin B-Konzentrationen folgt bereits in Woche 3 eine Aufregulation von Inhibin A, dem beim Hund dominanten Inhibin, welcher möglicherweise einer überschießenden Stimulation entgegensteuert.

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