Transport- und Bindungsmechanismen von thrombozytären Alloantikörpern und deren Assoziation zur fetalen und neonatalen Blutungsneigung

Abstract

Die fetale und neonatale Alloimmunthrombozytopenie (FNAIT) wird durch eine fetomaternale HPA (Humane Plättchen Alloantigene)-Inkompatibilität zwischen Mutter und Kind mit maternaler Alloantikörperbildung verursacht. Die Feten bzw. Neugeborenen können schwere hämorrhagische Diathesen erleiden. Bei Kaukasiern sind in der Mehrheit der Erkrankungen Plättchenalloantigene des alphaIIbbeta3 Fibrinogenrezeptors involviert, insbesondere HPA-1a und HPA-3a. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von einer variablen Anzahl von Tandem Repeats (VNTR) in der Promotorregion des diaplazentaren FcRn Rezeptors (Projekt 1), Epitopspezifität (Projekt 2), Affinität und Komplementbindungseigenschaften von Antikörpern (Projekt 3) als prädisponierende Faktoren auf die Schwere der FNAIT, sowie der Einfluss von unterschiedlichen Faktoren auf die Stabilität von HPA-3 Epitopen (Projekt 4) und die Effekte von Alloantikörpern auf humane Plättchen in vivo (Projekt 5) untersucht. Im ersten Projekt wurde die Auswirkung der beiden häufigsten FcRn Allele VNTR2 (7.5 %) und VNTR3 (92 %) auf die Transkriptionsaktivität des FcRn Promotors und die Expression des FcRn Rezeptors untersucht. Die Monozyten von VNTR3 homozygoten Individuen exprimieren das 1.66 Fache mehr an FcRn Transkript im Vergleich zu VNTR2/3 Heterozygoten (p = 0.002). In Übereinstimmung führt das VNTR3 Allel im Reportergen-Assay zu einer zweifach effektiveren Transkription des Reportergens (p < 0.01). Die geringere Menge an FcRn Transkript bei Trägern des VNTR2 Allels führt zu einer geringeren Rezeptordichte auf der Zelloberfläche von Monozyten, welche durch eine signifikant verminderte IgG Bindungskapazität (p = 0.021) reflektiert wird (Sachs U.J, Socher I., Braeunlich C.G., Kroll H., Bein G., Santoso S., 2006). Eine Assoziationsstudie mit 104 FNAIT Patienten ergab jedoch keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem VNTR Genotyp und der Schwere der Thrombozytopenie. Es wird daher postuliert, dass die differentielle FcRn Expression keine entscheidende Bedeutung für die klinische Heterogenität der FNAIT hat. Im zweiten Projekt wurde die Epitopspezifität von HPA-1a Alloantikörpern am Beispiel der natürlichen beta3-Leu33Val Punktmutation untersucht. Das Epitop der meisten HPA-1a Alloantikörper wird von der Länge des aliphatischen Seitenkettenrestes (CH2-Gruppe) der Aminosäure Leu33 (HPA-1a) kontrolliert, so dass ein Austausch der Aminosäure Leu gegen Val das HPA-1a Epitop zerstört. Nur in seltenen Fällen wird eine Kreuzreaktivität von HPA 1a Alloantikörpern mit der beta3-Val33 Variante beobachtet. Die Anwesenheit solcher Antikörper kann mit einer schweren Thrombozytopenie des Neugeborenen assoziiert sein. (Santoso S., Kroll H., Andrei-Selmer C.L., Socher I., Rankin A., Kretzschmar E., Watkins N.A., 2006). Im dritten Projekt wurde ein neues Testverfahren (Surface Plasmon Resonance, SPR) zur Echtzeitanalyse der HPA-1 Alloantikörperbindung erfolgreich etabliert. Dieses kann auch niedrig affine HPA-1 Alloantikörper nachweisen, welche in bisherigen Methoden einer Dissoziation unterliegen. Solche Alloantikörper können Ursache einer schweren Blutungskomplikation sein. Die Alloantikörperaffinität nimmt von der ersten zur zweiten Schwangerschaft zu. Diese Beobachtung reflektiert vermutlich eine Reifung der Immunantwort im Verlauf der FNAIT. Die Konzentration der maternalen HPA-1a Antikörper ist signifikant mit dem Blutungsrisiko des Neugeborenen korreliert (p = 0.037). Im vierten Projekt konnte gezeigt werden, dass die Mehrheit der HPA-3 Alloantikörper gegen eine komplexe antigene Determinate gerichtet ist, welche von der Struktur des alphaIIbbeta3 Komplexes bestimmt wird. Neben dieser alphaIIbbeta3 Integrinstruktur tragen Sialinsäuren maßgeblich zur Bildung von HPA-3 Epitopen bei. Beide Parameter bedingen offensichtlich eine beobachtete Lagerungsinstabilität der HPA-3 Epitopexpression. (Socher I., Zwingel C., Santoso S., Kroll H., 2007, accepted for publication in Transfusion, 14.08.2007). Im fünften Projekt wurde gezeigt, dass NOD/SCID Mäuse eine funktionelle in vivo Analyse der humanen Alloantikörperbindung mit Aussage über die pathogene Relevanz der Alloantikörper ermöglichen. Eine Analyse plättchenreaktiver Alloantikörper im Mausmodell und in vitro durch SPR-Technologie könnte zukünftig helfen, das Risiko einer drastischen Blutungskomplikation für den Feten bzw. Neugeborenen und deren Sterblichkeit zu senken. Fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT) results from feto-maternal HPA (Human platelet alloantigen) incompatibility with maternal alloantibody formation. The fetuses and newborns can suffer from severe haemorrhagic syndromes. Among Caucasians, platelet alloantigens localized on the platelet fibrinogen receptor alphaIIbbeta3 are most common in this disease, particularly HPA-1a and HPA-3a. In this study, the role of a variable number of tandem repeats (VNTR) polymorphism in the promoter region of the diaplacental FcRn receptor (project 1), epitope specificity (project 2), affinity and complement-fixing properties of alloantibodies (project 3) as predictable values for the severity of FNAIT, of different physical parameters on the stability of HPA-3 epitopes (project 4) and the effect of alloantibodies on human platelets in vivo (project 5) were analyzed. The first presented study reveals the effect of the most common FcRn alleles VNTR2 (7.5 %) and VNTR3 (92 %) on the diaplacental IgG transfer by analyzing the transcriptional activity of the FcRn promoter and the receptor expression. Monocytes from VNTR3 homozygous individuals express 1.66 fold more FcRn transcript than do monocytes from VNTR2/3 heterozygotes (p = 0.002). In reporterplasmid assays the VNTR3 allele transcribes the reporter gene twice as effectively as does the VNTR2 allele (p < 0.01). Finally, cells of VNTR2 carriers express less FcRn on the cellular surface leading to significant diminished IgG-binding capacity under acidic conditions (p = 0.021) (Sachs U.J, Socher I., Braeunlich C.G., Kroll H., Bein G., Santoso S., 2006). However, genotyping the VNTR alleles in a large cohort of 104 FNAIT cases revealed no significant association to the severity of FNAIT. Thus, I speculate that the differential FcRn expression has no significant meaning for the pathogenesis of FNAIT. The second study demonstrates the different epitope specificity of HPA-1a alloantibodies by characterization of the natural occurring Leu33Val point mutation. Most HPA-1a alloantibodies recognize an epitope that is controlled by the length of the aliphatic amino acid Leu33 residue; the substitution of leucine into valine impairs the formation of HPA-1a epitope. Only some HPA-1a alloantibodies can cross-react with the new Val33 variant. The presence of such alloantibodies might be responsible for severe thrombocytopenia of the newborn. (Santoso S., Kroll H., Andrei-Selmer C.L., Socher I., Rankin A., Kretzschmar E., Watkins N.A., 2006). In the third project a new method allowing real-time analysis of platelet HPA-1a alloantibody binding by surface plasmon resonance (SPR) technology was successfully established (Socher I., Kroll H., Santoso S., 2006). By this technique it was possible to demonstrate the presence of low-affinity HPA-1a alloabs that were missed by standard antigen capture immunoassay, most probably by dissociation of antibody during washing processes. These alloabs have the potential to cause severe thrombocytopenia. The observed increase in antibody affinity from the first to the second pregnancy may reflect a maturation process of the immune response in the course of FNAIT. The maternal antibody concentration correlates significantly with the bleeding risk of the newborn (p = 0.037). In the fourth project evidence was provided that the majority of HPA-3 alloantibodies recognize a more complex antigenic determinant comprising the alphaIIbbeta3 heterodimer. Beside the importance of three-dimensional alphaIIbbeta3 integrin structure, the presence of sialic acids is required for the stability of HPA-3 epitopes. These physical parameters seem to be related to a considerable instability of HPA-3 antigenic determinants observed during platelet storage at 4 °C (Socher I., Zwingel C., Santoso S., Kroll H., 2007, accepted for publication in Transfusion, 14.08.2007). In the fifth project it was demonstrated that a new NOD/SCID mouse model allows a functional analysis of alloantibody-mediated effects on human platelets with characterization of their pathogenic relevance in vivo. The implementation of this in vivo analysis and in vitro analysis by the use of SPR technology in prenatal diagnostic may help in the future to reduce the number of cases with severe FNAIT-related complications.