GMP-konforme Expansion und funktionelle Charakterisierung humaner mesenchymaler Stromazellen

Abstract

Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind aufgrund ihres Differenzierungspotential sowie ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften Gegenstand zahlreicher klinischer Studien. Ein häufiger Anwendungsbereich von MSC als Zelltherapeutikum ist die Behandlung der Transplantatabstoßung, nach einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation, in Form der Graft-versus-Host-Disease (GvHD). Dabei fällt die hohe Heterogenität der Studien, bezüglich der Kulturbedingungen, der Quelle, aus denen die MSC gewonnen wurden, die eingesetzte Zelldosis und diverser weiterer Faktoren auf. Die Konsequenz ist eine erheblich erschwerte Vergleichbarkeit der Studien untereinander sowie deren höchst unterschiedlichen Ergebnisse. MSC werden üblicherweise in vitro in Zellkulturflaschen in aufwändigen und schlecht standardisierbaren Prozeduren expandiert. Diese sind nur schwer in Einklang mit den Vorgaben der der Guten Herstellungspraxis (GMP) zu bringen. In dieser Arbeit wurde, unter Verwendung eines Bioreaktors, erstmals eine standardisierte Expansionsmethode für MSC etabliert, die den Regeln der Guten Herstellungspraxis entspricht. So war es möglich, in nur 2 Passagen, aus Knochenmarkaspirat über 400 Mio. MSC innerhalb kurzer Zeit ex-vivo zu expandieren. Durch den Einsatz von HPL als Ersatz von FCS war es möglich, auf den Einsatz xenogener Reagenzien zu verzichten. Die so erhaltenen MSC, entsprachen den Vorgaben der ISCT (International Society for Cellular Therapy) für Oberflächenmarker und Differenzierbarkeit. Eine Optimierung der Expansion, im Hinblick auf Zellausbeute und kürzerer Expansionsdauer, konnte durch die Verwendung hypoxischer Kulturbedingungen erreicht werden. Durch Anwendung des T-Zell Proliferationsassays war es möglich, bioreaktorexpandierte MSC hinsichtlich ihrer immunsuppressiven Kapazität zu überprüfen. So konnte in der vorliegenden Arbeit der negative Einfluss von erhöhter Passagenzahl (=5), Kryokonservierung und fehlender Äquilibrierung nach Auftauen der MSC, auf ihre Fähigkeit, die T-Zell Proliferation zu hemmen, gezeigt werden. Des Weiteren scheint die Hemmung der Proliferation von T-Zellen nicht nur von MSC-Seite vermittelt, sondern auch abhängig vom Ansprechverhalten der jeweiligen T-Zellen zu sein. Durch Bestrahlung der Zellen nach Expansion wurde die Proliferation der MSC aufgehoben, gleichzeitig blieben die Vitalität und die T-Zell suppressiven Eigenschaften der Zellen erhalten. Zusammenfassend bildet die vorliegende Arbeit die Basis für zukünftige, vergleichbare klinische Studien, anhand eines standardisierten ex vivo Expansion-Protokolls von MSC in GMP -konformer Weise.

Mesenchymal stromal cells (MSC) are subject of numerous clinical studies due to their differentiation potential and their immunomodulatory properties. A common application of MSC as a cellular therapeutic is the treatment of transplant rejection after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in the form of Graft-versus-host disease (GvHD). Pertinent studies, however, vary widely with respect to culture conditions, MSC source (e.g., bone marrow or adipose tissue), cell dose, etc., thus limiting comparability between these studies and therefore the ability to strengthen conclusions. To date, no standardized MSC culture conditions have been established to relieve this limitation and strengthen the conclusions of the field.MSC are typically expanded in vitro in cell culture flasks, a laborious and tedious process that is prone to variability. Consequently, this traditional process can present challenges regarding manufacture in accordance with Good Manufacturing Practice (GMP). In the current work, for the first time, a standardized method of MSC expansion was established using a bioreactor to conform to the rules of GMP. Additionally, the use of HPL as a replacement for FCS made it possible to achieve a xeno-free process. Results demonstrated the ability to achieve ex vivo yields of 400 million MSC within 2 passages. The cells were shown to meet the requirements of ISCT (International Society for Cellular Therapy) for surface markers and differentiation. An optimization of the expansion, with respect to cell yield, and a shorter duration of expansion were achieved by the use of hypoxic culture conditions. Moreover, the immunosuppressive capacity was assessed using a T-cell proliferation assay. Thus, in the present thesis, the immunosuppressive capacity was shown to diminish with increased passages (=5), cryopreservation and a lack of equilibration after thawing. Furthermore, the inhibition of T-cell proliferation seems not only to be dictated by the MSC, but also to be dependent on the response of the respective T-cell population. Irradiation after expansion led to proliferation stop but did not diminish the viability or their T-cell suppressive function of the MSC. In summary, the present thesis provides the basis for a comparability of future clinical studies, using a standardized ex vivo expansion protocol of MSC in GMP-compliant manner.